補體在流感病毒-金黃色葡萄球菌共感染致小鼠嚴重肺炎中的致病機制研究.pdf

1、研究背景:近年來研究表明，感染流感病毒的重癥及死亡病例中有50％～90％與細菌共感染有關。目前已報道能與流感病毒發(fā)生共感染的細菌有十多種，其中最為常見的有3種，分別是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及肺嗜血桿菌。研究表明，金葡菌與流感病毒共感染的死亡率最高。深入研究共感染過程中的致病機制，對于降低死亡率有重要意義。以往研究表明，在共感染的重癥與死亡病例中常伴有嚴重的肺部炎癥反應。而補體在許多疾病中被證明與炎癥損傷有關，那么補體是否在流感病毒/

2、細菌共感染所致炎癥反應中也起關鍵作用？目前這一問題尚不清楚，亦未見相關研究報道。因此，選擇以流感病毒和金葡菌構(gòu)建共感染小鼠模型，擬研究補體在共感染過程中的激活情況及其在致嚴重肺炎中的作用。
　　目的和意義:從機體的補體調(diào)節(jié)方面研究流感病毒/金葡菌共感染導致高死亡率的致病機制，探索補體調(diào)節(jié)作為治療共感染的可能性，為臨床上制定流感病毒/細菌共感染病例治療方案提供理論依據(jù)，從而最終達到降低死亡率的目的。
　　研究方法:以亞致死劑量

3、的流感病毒（PR8株）與耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA，簡稱金葡菌）建立共感染小鼠模型。利用不同的感染時機與次序等多種共感染策略，篩選出高死亡率共感染模型。通過病理切片、ELISA等方法檢測小鼠肺部炎癥病理反應及炎癥相關細胞因子的表達水平，特別是與補體相關炎性因子C3a與C5a的表達水平。利用免疫熒光技術檢測補體C3d蛋白分子在肺組織的沉積水平，檢測流感病毒與金葡菌在肺臟的分布及病原載量情況。最后利用補體缺陷(C3-/-，C5-/-，MB

4、L-/-)、補體抑制（C3aR-/-，C5aR抗體）及補體耗竭(CVF)等手段建立共感染小鼠模型，觀察肺部炎癥損傷程度與死亡率的變化等情況。
　　結(jié)果:小鼠僅在感染流感病毒0d～3d后感染金葡菌的死亡率最高(＞80％)，而其它共感染組的死亡率均較低，特別是先感染細菌后感染病毒組的死亡率＜40％。與對照組相比，高死亡率實驗組小鼠的體重也呈明顯下降趨勢。病理組織切片分析結(jié)果表明，d-2組小鼠肺組織損傷面積達約90％，肺指數(shù)也明顯升高，

5、均明顯高于對照組;同時伴有炎癥細胞（淋巴細胞和粒細胞）浸潤、肺泡萎縮或?qū)嵸|(zhì)化及鄰近肺泡融合或代償性擴張形成較大囊腔的肺大泡。d-2組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ等炎癥相關因子水平明顯高于對照組，特別是與補體相關炎性因子C3a和C5a的表達量明顯升高。組織免疫熒光檢測結(jié)果表明，共感染小鼠(d-2組)肺組織有大量的補體C3d蛋白分子沉積，甚至漫延至整個肺部，明顯多于其它對照組。補體三條通路的起始因子水平檢測結(jié)果表明，

6、在共感染組（d-2組）小鼠死亡高峰期，經(jīng)典途徑的起始因子C1q在d-2組小鼠肺部大量沉積，明顯高于對照組;旁路途徑起始因子CFBa與甘露糖-凝集素途徑起始因子MASP-2在血清中的水平均明顯高于對照組。補體調(diào)節(jié)蛋白檢測結(jié)果表明，共感染高死亡率組小鼠血清中補體負性調(diào)節(jié)蛋白(CFH、CFI、Crry、CR1、CD59、C4BP、DAF)的含量較對照組均有明顯下調(diào)，但正性調(diào)節(jié)蛋白(CFP、Nef)下調(diào)無顯著差異。C3-/-或C5-/-補體缺陷

7、小鼠共感染生存率均為100％，體重恢復良好且肺部無明顯損傷情況。過敏毒素C3a受體缺陷小鼠（C3aR-/-）共感染生存率率上升約50％，甘露糖凝集素缺陷小鼠(MBL-/-)共感染生存率上升約70％。眼鏡蛇毒因子(CVF)耗竭補體結(jié)果表明，與對照組相比，治療組生存率上升了近60％，且體重也有顯著地恢復。過敏毒素C5a受體抗體(Anti-C5 aR)治療共感染小鼠結(jié)果表明其生存率為70％，明顯高于野生型小鼠對照組。
　　結(jié)論:成功建立

8、了流感病毒/金葡菌共感染高死亡率小鼠模型，共感染的死亡率與兩種病原的感染次序及感染時機明顯相關，即小鼠僅在先感染流感病毒0d～3d后再感染金葡菌的死亡率最高(＞80％)，明顯高于其它共感染組。高死亡率共感染組小鼠的肺臟均伴有明顯的病理變化和嚴重的炎癥反應，提示嚴重的肺炎反應是造成高死亡率的重要原因之一。高死亡率共感染組小鼠嚴重肺炎進程中伴有補體過度激活，其中三條補體通路均被激活，提示補體的過度激活是造成肺部嚴重炎癥反應的重要原因之一。補

9、體的過度激活不僅與補體負性調(diào)節(jié)蛋白(CFH、CFI、Crry、CR1、CD59、C4BP、DAF)表達減少有關，而且兩種病原在小鼠肺部載量的增多與補體激活水平呈正相關。通過補體缺陷（C3-/-，C5-/-，MBL-/-）、補體抑制（C3aR-/-，C5aR抗體）及耗竭(CVF)等多種調(diào)節(jié)方式去除補體影響后，均能不同程度減緩共感染小鼠肺部炎癥反應、恢復病理損傷，且能降低死亡率，表明補體的過度激活是共感染致嚴重肺部炎癥反應的原因之一。研究結(jié)