金黃色葡萄球菌CapB2的致病作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌是常見的條件致病菌，能夠表達(dá)大量的毒力蛋白，可導(dǎo)致多種臨床疾病，而金黃色葡萄球菌的毒力由眾多調(diào)控因子所調(diào)控的毒力基因所決定。莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP）的產(chǎn)生與金黃色葡萄球菌的致病力有關(guān)，是金黃色葡萄球菌一種重要的免疫逃逸機(jī)制，其中capB2是合成莢膜多糖的重要組成部分，其致病作用受到廣泛重視。葡萄球菌輔助調(diào)控因子（Staphylococcal accessory re

2、gularA，sarA）在調(diào)控金黃色葡萄球菌毒力方面的作用非常重要。本研究旨在為了解CapB2在金黃色葡萄球菌致病方面的作用及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　利用PCR法擴(kuò)增金黃色葡萄球菌臨床分離株75(SA75)莢膜多糖的型特異性區(qū)域?qū)A75進(jìn)行莢膜多糖基因分型。PCR擴(kuò)增SA75的capB2基因上、下游同源臂，通過特定的酶切位點(diǎn)連接不含目的基因的上、下游片段，然后通過同源重組反應(yīng)構(gòu)建質(zhì)粒pKOR1-△capB2，將重

3、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DC10B進(jìn)行修飾，再電轉(zhuǎn)入SA75菌株中。經(jīng)過變溫傳代和四環(huán)素的誘導(dǎo)，篩選出capB2基因缺失突變菌株（△capB2）。利用PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)和基因測序?qū)Α鱟apB2篩選子進(jìn)行鑒定。分別擴(kuò)增含啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome Binding Site，RBS)的sarA基因全長和capB2基因的編碼區(qū)序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)將回復(fù)基因

4、與質(zhì)粒pRB473連接，將重組回復(fù)質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DC10B感受態(tài)細(xì)胞中，最后轉(zhuǎn)入△ capB2和sarA缺失突變株(△sarA)中，經(jīng)qPCR和測序鑒定回復(fù)成功。待基因缺失突變株及互補(bǔ)表達(dá)株構(gòu)建成功，建立皮膚膿腫模型比較△ capB2、△ capB2-C與野生株之間的毒力差異，確定capB2在金黃色葡萄球菌致病中的作用，并取膿液標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察，分析各組細(xì)菌間微莢膜厚度差異。使用qPCR的方法檢測調(diào)控因子sarA與金黃色葡萄球菌

5、capB2基因間的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　莢膜基因分型結(jié)果經(jīng)測序證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所使用的SA75屬于8型莢膜多糖(CP8)。將capB2上、下游1500 bp片段先后與克隆載體pET28a連接，通過同源重組反應(yīng)構(gòu)建pKOR1-△capB2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DC10B，最后電轉(zhuǎn)入SA75菌株中發(fā)生同源重組，經(jīng)篩選、測序確證后得到△capB2?；蛉笔蛔冎旰突パa(bǔ)表達(dá)株構(gòu)建成功后，繪制野生株、缺失突變株和互補(bǔ)表達(dá)株的生長曲線

6、，發(fā)現(xiàn)各菌株之間的生長曲線并無明顯差異。通過皮膚膿腫模型實(shí)驗(yàn)研究capB2基因所編碼的蛋白的功能。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)于感染的第4、5、6、7天，細(xì)菌△capB2組的膿腫面積明顯小于野生株SA75組，回復(fù)了capB2基因的互補(bǔ)表達(dá)株△capB2-C組的膿腫面積恢復(fù)到野生株水平。感染的第二至第十天，敲除株和互補(bǔ)表達(dá)株之間的膿腫面積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，整個(gè)感染過程中野生株和回復(fù)突變株之間的差異均不明顯(P＞0.05)。電鏡結(jié)果顯示

7、，△capB2組的微莢膜厚度最薄，互補(bǔ)表達(dá)株△ capB2-C組的微莢膜厚度恢復(fù)到接近野生株組水平。在調(diào)控關(guān)系上，提取△sarA、△sarA-C和野生株SA75細(xì)菌總RNA，qPCR檢測各菌株capB2基因表達(dá)水平的差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生株相比，△sarA株中capB2表達(dá)量上調(diào)326倍，而回復(fù)了sarA基因的△sarA-C，capB2的表達(dá)水平恢復(fù)到接近野生株水平，提示sarA能抑制capB2基因的表達(dá)，對capB2具有負(fù)調(diào)控的作用。<