microRNA-125b調(diào)控心肌梗死后炎癥的作用及其在不同心臟組成細(xì)胞中的調(diào)控作用.pdf

1、目的:研究小鼠心肌梗死后，微小RNA-125b(miR-125b)調(diào)控高遷移率族蛋白1(HMGB1)釋放誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其對心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等3種參與心梗進(jìn)展調(diào)節(jié)的細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)建立小鼠(C57BL/6)心梗模型，采用RT-PCR方法檢測心梗早期3d或5d miR-125b及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死

2、因子-α(TNF-α)的表達(dá)變化;用免疫組化和免疫熒光方法檢測小鼠心肌梗死后內(nèi)源性HMGB1的表達(dá)。構(gòu)建miR-125b過表達(dá)腺病毒及對照腺病毒載體感染心梗后心臟組織，應(yīng)用心臟彩超觀察心梗后miR-125b過表達(dá)對小鼠心功能的影響。
　　(2)體外實驗研究:合成重組小鼠HMGB1蛋白作為炎性介質(zhì)進(jìn)行體外研究。選擇心梗后參與疾病病程調(diào)控的3種心臟組成細(xì)胞:心肌細(xì)胞系H9C2、成纖維細(xì)胞系10T1/2和原代巨噬細(xì)胞作為研究對象。使用m

3、iR-125b過表達(dá)腺病毒及對照腺病毒載體體外感染H9C2和10T1/2細(xì)胞;合成miR-125b模擬物miR-125b mimic或?qū)φ漳M物control mimic轉(zhuǎn)染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞;通過RT-PCR和ELISA技術(shù)分別檢測3種心臟組成細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA及其細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白水平。用Western blot方法檢測巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)核因子κB(NF-kB)和絲裂原活化蛋白激酶(M

4、APK)信號通路中P65、C-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平。
　　(3)心梗后感染過表達(dá)miR-125b及對照腺病毒的心臟組織予CD11b+細(xì)胞磁珠分選出巨噬細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測其IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)小鼠心梗炎癥期心肌組織中miR-125b表達(dá)增加。小鼠心梗術(shù)后第3d，心梗組心梗邊緣心肌組織miR-125b

5、表達(dá)量(6.10±0.11)較假手術(shù)組(SHAM組)(1.00±0.00)顯著增加，術(shù)后第5d，心梗組miR-125b mRNA表達(dá)量(2.42±0.06)較SHAM組(1.00±0.00)顯著增加。心梗后心臟過表達(dá)miR-125b的小鼠術(shù)后2w及4w，實驗組心功能檢測LVEF及LVFS值較對照組均顯著下降，術(shù)后2w，LVEF(60.33±9.07)％vs(68.67±1.52)％,LVFS(29.02±0.71)％vs(33.26±4

6、.24)％;術(shù)后4w,LVEF(56.23±1.04)％vs(64.02±4.58)％,LVFS(20.50±2.12)％vs(24.63±2.83)％。
　　(2)同一時期檢測到心肌組織和梗死邊緣區(qū)內(nèi)源性危險分子HMGB1表達(dá)增加以及大量炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。心梗第5d，免疫組化顯示心梗組梗死邊緣區(qū)心肌組織中HMGB1蛋白表達(dá)較SHAM組增加;心梗第3d，心梗組梗死邊緣區(qū)心肌組織免疫熒光可見標(biāo)記紅色熒光的HMGB1陽性信號較SHAM

7、組增加。心肌梗死第3d和第5d，心梗組梗死邊緣組織IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA水平均較SHAM組顯著增高。
　　(3)使心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-125b，HMGB1誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)PCR檢測結(jié)果:原代巨噬細(xì)胞，過表達(dá)miR-125b可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的產(chǎn)生。刺激3h，IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA的表達(dá)水平比

8、較，miRNA-125b過表達(dá)實驗組較對照組均不同程度地增高，IL-1βmRNA[(2815.44±199.02) vs(1087.5±67.18),(p＜0.05)];IL-6mRNA[(5.55±2.12) vs(3.05±0.78),(p＞0.05)];IL-12mRNA[(260.51±52.32) vs(147.08±26.87),(p＜0.01)];TNF-α mRNA[(54.00±10.68) vs(40.62±8.83

9、)，(p＞0.05）];而刺激6h，實驗組較對照組IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA相對表達(dá)亦顯著增高，IL-1β mRNA[(11093.48±2637.83) vs(5313.987±1022.94),(p＜0.01)]; IL-6 mRNA[(20.23±3.91) vs(6.16±1.19),(p＜0.01)];IL-12 mRNA[(484.56±36.14) vs(245.50±30.41),(p＜0.0

10、1)];TNF-αmRNA(84.22±22.65) vs(60.30±9.28)，(p＜0.01)]。ELISA法檢測HMGB1刺激巨噬細(xì)胞胞培養(yǎng)上清液炎性細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，刺激3h，上清中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α水平，過表達(dá)miR-125b實驗組與對照組比較有不同程度的升高，但兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而刺激6h，實驗組上述細(xì)胞因子水平比對照組，顯著升高，IL-1β[(480.32±113.14)vs(3

11、30.87±70.71)，(p＜0.05);IL-1β[(688.09±72.12) vs(405.71±42.43),(p＜0.01)];IL-12[(32.55±4.95)vs(19.50±3.54),(p＜0.05)];TNF-α[(2264.5±161.93)vs(1393.18±193.74),(p＜0.05)]。在心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的刺激培養(yǎng)實驗中，IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA水平及細(xì)胞外上清液蛋

12、白水平亦有不同程度變化，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)小鼠心梗模型中，miR-125b過表達(dá)及對照腺病毒感染心臟組織（心梗同時）分離出的巨噬細(xì)胞其炎性細(xì)胞因子表達(dá)PCR結(jié)果顯示:實驗組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平較對照組增高。
　　(5) Western Blot結(jié)果，過表達(dá)miR-125b選擇性正向調(diào)控rmHMGB1誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，過表達(dá)miR-125b實驗組與對照組比較，僅有P65磷