低頻振動對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞鈣內(nèi)流和自噬流的影響及分子機制.pdf

1、前庭功能障礙嚴重影響患者的工作和生活質(zhì)量，尤其是眩暈。前庭功能紊亂或障礙帶來的周圍型眩暈有著較高的發(fā)病率，如常見的梅尼埃病，除了前庭癥狀外，該病還伴有耳悶、耳鳴以及聽力下降等耳蝸癥狀。藥物治療、手法操作、手術治療以及各種前庭康復廣為開展。低頻振動作為新穎的治療手段在門診治療中，改善了患者的總體感覺，控制了眩暈，減輕耳鳴和耳悶癥狀，并增加了患者的頭部舒適感。本研究觀察了低頻振動對單側前庭功能低下患者眩暈恢復的促進作用，經(jīng)乳突投放低頻振動，

2、明顯促進了眩暈的康復過程。為了進一部探尋低頻振動在治療眩暈癥狀上的作用機制，從細胞學和分子生物學上探索低頻振動是如何達到控制并改變內(nèi)耳前庭細胞的功能。本實驗課題利用公認研究脈管系統(tǒng)的模型細胞，即人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)，建立其轉染mRFP-GFP-LC3腺病毒和線粒體毒素干擾自噬的實驗模型。觀察低頻振動對HUVEC細胞鈣內(nèi)流和自噬流的影響，并與氟桂利嗪陽性對照組比較。采用磷酸化廣譜篩選抗體芯片，分析低頻振動對線粒體損傷的HUVE

3、C細胞的信號通路蛋白磷酸化水平的影響，進而探索低頻振動對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞影響的分子機制。
　　第一部分低頻振動剪切應激治療單側前庭功能低下的療效分析
　　目的：探討低頻振動在單側前庭功能低下患者眩暈康復中的作用。
　　方法：共收集我院門診的診斷為單側前庭功能低下患者25人，均為前庭神經(jīng)元炎后遺癥，分為低頻振動治療組和常規(guī)前庭康復治療組。低頻振動治療組采用經(jīng)患側乳突進行100Hz低頻振動，每次30分鐘，每周2次，連續(xù)

4、治療2周。前庭康復治療組患者在康復科康復治療師指導下采用TECNOBODY平衡測試及訓練系統(tǒng)進行感覺整合訓練、前庭功能訓練、重心控制訓練。兩組患者分別于治療前、治療后進行DHI評分及VVAS評分。所有計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差方式記錄，采用SPSS軟件進行方差分析。計量資料采用卡方檢驗進行統(tǒng)計分析，取p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：按照DHI總分改善18分以上為有效，低頻振動治療組總有效率為76.9％(10/13)，前庭康復

5、組為83.3％(10/12)，經(jīng)卡方檢驗兩組差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：經(jīng)乳突低頻振動與傳統(tǒng)的前庭康復鍛煉對眩暈癥狀的改善效率相當，對患者無其他不良影響。相對于前庭康復鍛煉需要專業(yè)的康復師和專業(yè)的場地而言，低頻振動治療前庭功能障礙操作簡便，對場地無特殊要求，技術員培訓難度低。本研究結果顯示，低頻振動治療前庭功能低下的短期效果明顯，長期效果還需要增加樣本量及進一步延長隨訪時間。
　　第二部分低頻振動對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞鈣內(nèi)

6、流的影響
　　目的：了解低頻振動在調(diào)節(jié)人臍血內(nèi)皮細胞鈣內(nèi)流方面的作用。
　　方法：利用人臍血內(nèi)皮細胞(HUEVC)作為模型細胞，用FLUO-3鈣離子示蹤劑顯示細胞內(nèi)鈣離子的實時變化，用3-NP處理建立細胞損傷的模型，用低頻振動對其進行治療干預，用氟桂利嗪作為陽性對照。通過熒光顯微鏡結合圖像分析和半定量測試，實時觀察3-NP誘導鈣內(nèi)流的變化以及低頻振動干預治療后，細胞鈣內(nèi)流發(fā)生的改變。
　　結果：與正常細胞相比，3NP處

7、理后的HUEVC細胞，綠色熒光強度明顯加強，出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。3NP處理后的HUEVC細胞，分別施加低頻振動，或者加入氟桂利嗪，在3NP+低頻振動組和3NP+氟桂利嗪組，分別在1分鐘，5分鐘，15分鐘，20分鐘，30分鐘，與3-NP處理后的HUVEC細胞，即造模細胞相比，在不同時間點的比較上，綠色熒光強度明顯降低，鈣超載水平逐步降低。通過半定量熒光值的統(tǒng)計分析，具有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　結論：低頻振動可以明顯降低了因受線粒體損傷而

8、增強的鈣內(nèi)流。
　　第三部分低頻振動對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞自噬流的影響
　　目的：了解低頻振動在調(diào)節(jié)內(nèi)耳血管功能方面的可能自噬因素。
　　方法：利用人臍血內(nèi)皮細胞(HUEVC)作為模型細胞，用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染使其表達熒光標記自噬標志性的微管相關蛋白1輕鏈3，用3-NP處理建立細胞損傷的模型，用低頻振動對其進行治療干預，用氟桂利嗪作為陽性對照。通學過激光共聚焦顯微鏡，從形態(tài)學上，實時觀察3-NP誘導自噬

9、流的變化。用全自動流式細胞儀，定量觀測經(jīng)轉染mRFP-GFP-LC3腺病毒后的HUVEC細胞自噬流的變化。
　　結果：與正常細胞相比，3NP處理減少了自噬小體（綠色）的數(shù)量，更多地與溶酶體融合（黃和紅色）。在經(jīng)3NP處理后，分組分別加入氟桂利嗪，或者低頻振動，在3NP低頻振動和氟桂利嗪均明顯提高了HUVEC細胞的自噬率。定量熒光值的統(tǒng)計分析，具有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　結論：低頻振動可以明顯提高了因受因為線粒體損傷而降低的自

10、噬水平。低頻振動有可能通過影響細胞的自噬，而抑制過渡的炎癥反應，從而緩解內(nèi)耳損傷的病理過程。
　　第四部分低頻振動對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞影響的分子機制
　　目的：探索低頻振動對線粒體損傷后HUVEC細胞的信號通路蛋白磷酸化水平的影響，進而研究低頻振動干預線粒體損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞病理過程的分子機制。
　　方法：采用信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片(PEX100)，利用三維高分子膜專利技術，在片基上高密度結合1318

11、種高特異抗體。對HUVEC細胞的全細胞蛋白進行檢測。共分為四組，空白對照組，3-NP造模組，3-NP+氟桂利嗪組以及3-NP+低頻振動組。以氟桂利嗪，鈣離子阻滯劑作為陽性對照。對4組細胞分別進行檢測432個信號蛋白的679個磷酸化位點。對檢測出的通道進行數(shù)據(jù)分析，公式計算，組間比較，進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。
　　結果：與3-NP造模組未受干預的細胞相比，低頻振動組增加其磷酸化水平6倍以上的主要信號通路蛋白有:NMDAR2B(Phosp

12、ho-Tyr1472)，MEK1(Phospho-Ser298)，Lamin A/C(Phospho-Ser392)，HDAC1(Phospho-Ser421)，PECAM-1(Phospho-Tyr713),P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363)，P90RSK(Phospho-Thr573)，LAT(Phospho-Tyr171),PP2A-alpha(Phospho-Tyr307)，Merlin(Phospho-

13、Ser10)，MKK4/SEK1(Phospho-Ser80),BLNK(Phospho-Tyr96)，14-3-3zeta/delta(Phospho-Thr232)。與3-NP造模組未受干預的細胞相比，低頻振動組增加其磷酸化水平6倍以上的主要信號通路蛋白有:NMDAR2B(Phospho-Tyr1472)，MEK1(Phospho-Ser298)，LaminA/C(Phospho-Ser392)，HDAC1(Phospho-Ser4

14、21)，PECAM-1(Phospho-Tyr713)，P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363),P90RSK(Phospho-Thr573)，LAT(Phospho-Tyr171)，PP2A-alpha(Phospho-Tyr307)，Merlin(Phospho-Ser10)，MKK4/SEK1(Phospho-Ser80)，BLNK(Phospho-Tyr96),14-3-3zeta/del(Phospho-Th