TGFβ1誘導(dǎo)HSCs轉(zhuǎn)化成CAFs在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、目的:本研究將三株不同侵襲性的肝癌細(xì)胞SMMC-7721、BEL-7402、HepG2分別與肝星狀細(xì)胞(HSCs) LX2細(xì)胞transwell共培養(yǎng)，論證肝癌微環(huán)境中TGFβ1（TGFβ1）可以促進(jìn)LX2細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）轉(zhuǎn)化，LX2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs后促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。研究結(jié)果將為探討HSCs以及TGFβ1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為尋找肝癌治療新靶

2、標(biāo)提供方向。
　　方法:
　?、貺X2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞（SMMC-7721、BEL-7402、HepG2）分別共培養(yǎng)，觀察LX2細(xì)胞形態(tài)變化。用TGFβ1刺激LX2細(xì)胞，觀察LX2細(xì)胞形態(tài)改變。
　?、诓煌瑵舛鹊腡GFβ1及其抑制劑SB525334處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與肝癌細(xì)胞（SMMC-7721、BEL-7402、HepG2）共培養(yǎng)的LX2細(xì)胞，RT-PCR檢測CAFs相關(guān)分子α-SMA、FAP、Desmin等mRNA表達(dá)

3、水平的變化;Western Blot檢測α-SMA、FAP、Desmin蛋白表達(dá)水平的變化;
　?、鄄煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402遷移侵襲能力的變化;
　?、懿煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞（SMMC-7721、BEL-7402、Hep

4、G2），實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)EMT相關(guān)分子E-cadherin、vimentin等mRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平的變化;
　?、莶煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞（SMMC-7721、BEL-7402、HepG2），實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞(SMMC-7

5、721、BEL-7402、HepG2)中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子EGF、VEGF、MMPsmRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測MMP2、VEGF蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　?、貺X2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48h或者TGFβ1刺激后，其形態(tài)發(fā)生變化，由星形或多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形、扁平長梭形，細(xì)胞呈兩極生長，細(xì)胞突觸明顯減少;
　　②LX2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞(

6、SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48 h后，在mRNA水平，其CAFs相關(guān)分子α-SMA或FAP的表達(dá)顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的LX2后，TGFβ1可以顯著促進(jìn)α-SMA、FAP在基因水平的表達(dá)，其效應(yīng)可以被TGFβ1抑制劑所取消;在蛋白水平，TGFβ1可以顯著促進(jìn)α-SMA、Desmin、FAP的表達(dá)，抑制劑可以取消TGFβ1的作用;
　　③與LX2細(xì)胞共

7、培養(yǎng)后，BEL-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增加，不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理后，結(jié)果顯示TGFβ1可以顯著提高BEL-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力，TGFβ1的抑制劑可以取消上述效應(yīng);
　?、芘cLX2細(xì)胞共培養(yǎng)后，在mRNA水平，肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)顯著降低，間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin的表達(dá)顯著升高，調(diào)控EMT過程的轉(zhuǎn)錄因子Twist的表達(dá)顯著升高，BEL-

8、7402及HepG2間質(zhì)標(biāo)志物fibronectin表達(dá)升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，TGFβ1可以抑制E-Cadherin的表達(dá)，顯著促進(jìn)Vimentin的表達(dá)，抑制劑可以取消TGFβ1的作用;在蛋白水平，肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)后，E-Cadherin的表達(dá)降低，Vimentin的表達(dá)顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與L

9、X2共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞（SMMC-7721、BEL-7402、HepG2）后，TGFβ1可以抑制E-Cadheri的表達(dá)，顯著促進(jìn)Vimentin的表達(dá)，抑制劑可以取消TGFβ1的作用。
　?、菖cLX2細(xì)胞分別共培養(yǎng)后，在mRNA水平，三株肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子發(fā)生變化;SMMC-7721細(xì)胞中EGF、VEGF、MMP1、MMP2、MMP9、MMP13的表達(dá)顯著升高，BEL-7402細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP9表達(dá)顯著升高，H

10、epG2細(xì)胞VEGF、MMP1表達(dá)顯著增高;在蛋白水平，SMMC-7721細(xì)胞中MMP2的表達(dá)顯著升高，BEL-7402、HepG2細(xì)胞中MMP2、VEGF表達(dá)顯著增高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與LX2共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后，在mRNA水平，TGFβ1可以顯著上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞MMP2、VEGF的表達(dá)，且共培養(yǎng)體系中升高的更為明顯，TGFβ1的作用可以被其抑制劑