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文檔簡介
1、目的:本研究將三株不同侵襲性的肝癌細(xì)胞SMMC-7721、BEL-7402、HepG2分別與肝星狀細(xì)胞(HSCs) LX2細(xì)胞transwell共培養(yǎng),論證肝癌微環(huán)境中TGFβ1(TGFβ1)可以促進(jìn)LX2細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)轉(zhuǎn)化,LX2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs后促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。研究結(jié)果將為探討HSCs以及TGFβ1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為尋找肝癌治療新靶
2、標(biāo)提供方向。
方法:
?、貺X2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng),觀察LX2細(xì)胞形態(tài)變化。用TGFβ1刺激LX2細(xì)胞,觀察LX2細(xì)胞形態(tài)改變。
?、诓煌瑵舛鹊腡GFβ1及其抑制劑SB525334處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)共培養(yǎng)的LX2細(xì)胞,RT-PCR檢測CAFs相關(guān)分子α-SMA、FAP、Desmin等mRNA表達(dá)
3、水平的變化;Western Blot檢測α-SMA、FAP、Desmin蛋白表達(dá)水平的變化;
?、鄄煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402,Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402遷移侵襲能力的變化;
?、懿煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、Hep
4、G2),實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)EMT相關(guān)分子E-cadherin、vimentin等mRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平的變化;
?、莶煌瑵舛萒GFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)和與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2),實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞(SMMC-7
5、721、BEL-7402、HepG2)中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子EGF、VEGF、MMPsmRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測MMP2、VEGF蛋白表達(dá)水平的變化。
結(jié)果:
?、貺X2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48h或者TGFβ1刺激后,其形態(tài)發(fā)生變化,由星形或多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形、扁平長梭形,細(xì)胞呈兩極生長,細(xì)胞突觸明顯減少;
②LX2細(xì)胞與肝癌細(xì)胞(
6、SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48 h后,在mRNA水平,其CAFs相關(guān)分子α-SMA或FAP的表達(dá)顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的LX2后,TGFβ1可以顯著促進(jìn)α-SMA、FAP在基因水平的表達(dá),其效應(yīng)可以被TGFβ1抑制劑所取消;在蛋白水平,TGFβ1可以顯著促進(jìn)α-SMA、Desmin、FAP的表達(dá),抑制劑可以取消TGFβ1的作用;
③與LX2細(xì)胞共
7、培養(yǎng)后,BEL-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增加,不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理后,結(jié)果顯示TGFβ1可以顯著提高BEL-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力,TGFβ1的抑制劑可以取消上述效應(yīng);
?、芘cLX2細(xì)胞共培養(yǎng)后,在mRNA水平,肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)顯著降低,間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin的表達(dá)顯著升高,調(diào)控EMT過程的轉(zhuǎn)錄因子Twist的表達(dá)顯著升高,BEL-
8、7402及HepG2間質(zhì)標(biāo)志物fibronectin表達(dá)升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721后,TGFβ1可以抑制E-Cadherin的表達(dá),顯著促進(jìn)Vimentin的表達(dá),抑制劑可以取消TGFβ1的作用;在蛋白水平,肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)與LX2細(xì)胞共培養(yǎng)后,E-Cadherin的表達(dá)降低,Vimentin的表達(dá)顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與L
9、X2共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,TGFβ1可以抑制E-Cadheri的表達(dá),顯著促進(jìn)Vimentin的表達(dá),抑制劑可以取消TGFβ1的作用。
?、菖cLX2細(xì)胞分別共培養(yǎng)后,在mRNA水平,三株肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子發(fā)生變化;SMMC-7721細(xì)胞中EGF、VEGF、MMP1、MMP2、MMP9、MMP13的表達(dá)顯著升高,BEL-7402細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP9表達(dá)顯著升高,H
10、epG2細(xì)胞VEGF、MMP1表達(dá)顯著增高;在蛋白水平,SMMC-7721細(xì)胞中MMP2的表達(dá)顯著升高,BEL-7402、HepG2細(xì)胞中MMP2、VEGF表達(dá)顯著增高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨(dú)培養(yǎng)以及與LX2共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,在mRNA水平,TGFβ1可以顯著上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞MMP2、VEGF的表達(dá),且共培養(yǎng)體系中升高的更為明顯,TGFβ1的作用可以被其抑制劑
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