多孔β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載抗結核藥物緩釋系統(tǒng)的3D打印制備及初步研究.pdf

1、我國是結核病高發(fā)國家，在全球，發(fā)病率僅次于印度。在國內，結核病發(fā)病率也始終處于前列。在所有結核病人中，約有10-15％是肺外結核，而肺外結核居首位的是骨與關節(jié)的結核。臨床上，骨結核病人十分常見。骨結核最常用的治療方法是外科清除骨結核病灶。結核病灶清除后，留有結核性骨缺損。目前，國內醫(yī)療市場尚無修復結核性骨缺損植入材料制式產(chǎn)品。在修復普通骨缺損方面，近年來，涌現(xiàn)出了很多的新材料，也有很多新工藝，并有企業(yè)生產(chǎn)的制式產(chǎn)品。但這些產(chǎn)品在修復結核

2、性骨缺損方面，有許多不盡人意的地方，諸如：材料只有修復骨缺損作用而沒有抗結核作用；結核性骨缺損比一般骨缺損恢復慢，材料吸收降解和成骨填充作用不能達到很好匹配等。在修復結核性骨缺損方面，還處于研究階段，許多學者構建了許多新材料，但也不免有抗結核藥物成分單一，藥物釋放不穩(wěn)定，濃度過大影響成骨作用，濃度過小不能殺滅結核桿菌，而且造成機體耐藥性增加。因此，我們設計了一種既具有充填骨缺損、重建和誘導成骨作用，又具有局部持續(xù)、立體緩慢釋放抗結核藥物

3、的新型藥物緩釋骨修復支架材料，來解決臨床上骨關節(jié)結核病灶清除術后的結核性骨缺損修復。
　　本研究根據(jù)骨組織工程原理，將抗結核緩釋微球負載于骨組織工程支架里，制成抗結核復合骨組織工程材料。骨組織工程支架以β-磷酸三鈣做為基礎材料，通過3D打印工藝制備成網(wǎng)格狀結構。采用利福平和異煙肼分別制作成一定直徑的聚乳酸-羥基乙酸共聚物抗結核藥物微球。研制成既具有骨修復作用，又具有抗結核作用的功能性材料，并進行了部分體外、部分體內系列實驗，以期為

4、結核性骨缺損尋找到一種理想的具有抗結核藥物局部釋放，又具有骨組織修復功能的修復材料。
　　一、3D打印β-磷酸三鈣支架負載抗結核緩釋藥物復合材料的制備、特征和力學性能
　　本實驗復合材料采用3D打印方法制備，采用噴墨式工藝制成具有抗結核作用的功能性復合骨組織工程材料。通過環(huán)境掃描電鏡觀察顯示該材料在支架區(qū)有微觀多孔隙結構，微孔分布均勻，微觀孔隙互相連通，大小相仿，孔徑2?8μm。經(jīng)檢測，三維多孔β-磷酸三鈣支架總孔隙率檢測為

5、(61.76±2.53)%，其中宏觀孔隙率約為42.5%，微觀孔隙率為19.26%。RFP/PLGA微球呈現(xiàn)暗紅色；RFP/PLGA微球呈現(xiàn)白色。在RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球周圍有未能包封藥物的PLGA小微球存在。電子掃描顯微鏡觀察見微球形態(tài)呈球形，表面布滿規(guī)則的0.5μm?1.5μm大小的小孔，這些小孔是 RFP和INH釋放的通道。環(huán)境掃描電鏡觀察顯示該材料在支架區(qū)有微觀多孔隙結構，微孔分布均勻，微觀孔隙互相連通，大小

6、相仿，孔徑2μm~8μm。該材料在負載藥物微球區(qū)，即支架網(wǎng)格狀結構的孔隙區(qū)，宏觀孔隙400μm，RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球直徑200μm~300μm，分布均勻，實心微球是RFP/PLGA微球，空心微球INH/PLGA微球。微球均勻的分布在β-TCP支架上，三維多孔β-TCP負載 RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球的總孔隙率經(jīng)檢測為(30.59±1.33)%。燒結后和原材料的β-TCP支架X射線衍射分析圖譜顯示，燒

7、結前后無相轉變。取燒結后的β-TCP支架通過抗壓強度測試，孔隙400μm的β-TCP支架承受抗壓能力最大，最大壓縮強度為(3.31±0.64)MPa，力學性能可以達到松質骨的抗壓強度2-12 MPa。
　　二、多孔β-TCP支架負載抗結核藥物緩釋微球體外藥物釋放和降解
　　通過該復合材料體外釋放和降解實驗，驗證材料抗結核、成骨、降解吸收的匹配程度，為體內實驗提供數(shù)據(jù)支持。結果表明，RFP/PLGA和INH/PLGA微球的載藥

8、率分別為26.0±1.2%與28.0±1.5%；每個多孔β-TCP支架的質量為401.0±13.2mg（n=10），β-TCP負載50%RFP/PLGA微球和50%INH/PLGA微球后，質量約增加79.0±7.6mg，負載藥物21.33±2.34mg(RFP和INH總量)。該材料平穩(wěn)釋放藥物約90d。在體外降解過程中，材料質量隨著時間變化而逐漸降低，在15周時，材料降解質量趨于0。在降解過程中，材料的PH值逐步降低，然后在輕微升高。在

9、降解過程中多孔β-TCP支架負載RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球材料抗壓強度逐漸降低。本實驗材料在體外降解中抗壓強度變化較小，開始抗壓強度為3.31Mpa，第4周時為3.11 Mpa，第8周時為3.04 Mpa，第12周時為2.98 Mpa，第13周以后無法測定。
　　三、多孔β-TCP支架負載抗結核藥物緩釋微球體外細胞毒性試驗
　　通過該實驗旨在評價該材料的體外生物相容性和成骨性能。該復合材料和鼠骨髓間充質干細胞

10、共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞生長旺盛，在材料邊界細胞生長密集，對照組24，48，72 h細胞生長通過單位面積計數(shù)，發(fā)現(xiàn)與實驗組24，48，72 h細胞數(shù)量和陰性對照組無明顯差異，兩組細胞形態(tài)、細胞之間距離均無明顯差異。通過金相顯微鏡觀察多孔β-TCP支架小梁的顯微結構和共同培養(yǎng)的細胞，觀察熒光染色后的細胞，細胞在多孔β-TCP支架小梁的分布呈簇擁狀，可見細胞生長于多孔材料表面和孔隙中，有些已經(jīng)進入支架內部。掃描電鏡觀察可見在β-磷酸三鈣孔隙有大鼠

11、骨髓間充質干細胞，細胞呈梭形和不規(guī)則形，與材料表面黏附，在材料表面細胞貼壁、密集生長，長勢活躍，并伸出偽足附著材料表面。
　　四、多孔β-TCP支架負載抗結核藥物緩釋微球的體內實驗
　　通過對三維多孔β-TCP支架負載RFP/PLGA緩釋微球和INH/PLGA緩釋微球材料的特性進行了系列的體內實驗研究，證實了多孔β-TCP支架負載抗結核緩釋微球材料具有良好的緩釋特性，三維多孔β-TCP骨組織工程支架有良好的充填骨缺損和促進成

12、骨作用。對實驗兔隨機抽樣進行X線攝片，四組骨缺損修復的X線表現(xiàn)載藥組和未載藥組的實驗結果和體外實驗結果基本一致。常規(guī)CT研究其體內降解，結果和體外實驗結果基本一致。Micro-CT研究其新骨形成，結果顯示載藥組與未載藥組在術后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積無明顯差異（P＞0.05）；載藥組與對照組，未載藥組與對照組在術后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）；載藥組與空白組，未載藥組與空白組在術

13、后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）；對照組與空白組在術后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）。
　　以上結果說明，本實驗構建的β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載復合抗結核緩釋藥物復合材料具有較強的抗結核和骨修復雙重作用，其組織相容性良好，降解吸收、成骨、藥物釋放等達到了完美匹配，達到了實驗設計要求。提示其在未來臨床應用中會發(fā)揮它抗結核和骨修復雙重作用，為結核性骨缺損修