多孔β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載抗結(jié)核藥物緩釋系統(tǒng)的3D打印制備及初步研究.pdf

1、我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家，在全球，發(fā)病率僅次于印度。在國(guó)內(nèi)，結(jié)核病發(fā)病率也始終處于前列。在所有結(jié)核病人中，約有10-15％是肺外結(jié)核，而肺外結(jié)核居首位的是骨與關(guān)節(jié)的結(jié)核。臨床上，骨結(jié)核病人十分常見。骨結(jié)核最常用的治療方法是外科清除骨結(jié)核病灶。結(jié)核病灶清除后，留有結(jié)核性骨缺損。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)療市場(chǎng)尚無修復(fù)結(jié)核性骨缺損植入材料制式產(chǎn)品。在修復(fù)普通骨缺損方面，近年來，涌現(xiàn)出了很多的新材料，也有很多新工藝，并有企業(yè)生產(chǎn)的制式產(chǎn)品。但這些產(chǎn)品在修復(fù)結(jié)核

2、性骨缺損方面，有許多不盡人意的地方，諸如：材料只有修復(fù)骨缺損作用而沒有抗結(jié)核作用；結(jié)核性骨缺損比一般骨缺損恢復(fù)慢，材料吸收降解和成骨填充作用不能達(dá)到很好匹配等。在修復(fù)結(jié)核性骨缺損方面，還處于研究階段，許多學(xué)者構(gòu)建了許多新材料，但也不免有抗結(jié)核藥物成分單一，藥物釋放不穩(wěn)定，濃度過大影響成骨作用，濃度過小不能殺滅結(jié)核桿菌，而且造成機(jī)體耐藥性增加。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種既具有充填骨缺損、重建和誘導(dǎo)成骨作用，又具有局部持續(xù)、立體緩慢釋放抗結(jié)核藥物

3、的新型藥物緩釋骨修復(fù)支架材料，來解決臨床上骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶清除術(shù)后的結(jié)核性骨缺損修復(fù)。
　　本研究根據(jù)骨組織工程原理，將抗結(jié)核緩釋微球負(fù)載于骨組織工程支架里，制成抗結(jié)核復(fù)合骨組織工程材料。骨組織工程支架以β-磷酸三鈣做為基礎(chǔ)材料，通過3D打印工藝制備成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。采用利福平和異煙肼分別制作成一定直徑的聚乳酸-羥基乙酸共聚物抗結(jié)核藥物微球。研制成既具有骨修復(fù)作用，又具有抗結(jié)核作用的功能性材料，并進(jìn)行了部分體外、部分體內(nèi)系列實(shí)驗(yàn)，以期為

4、結(jié)核性骨缺損尋找到一種理想的具有抗結(jié)核藥物局部釋放，又具有骨組織修復(fù)功能的修復(fù)材料。
　　一、3D打印β-磷酸三鈣支架負(fù)載抗結(jié)核緩釋藥物復(fù)合材料的制備、特征和力學(xué)性能
　　本實(shí)驗(yàn)復(fù)合材料采用3D打印方法制備，采用噴墨式工藝制成具有抗結(jié)核作用的功能性復(fù)合骨組織工程材料。通過環(huán)境掃描電鏡觀察顯示該材料在支架區(qū)有微觀多孔隙結(jié)構(gòu)，微孔分布均勻，微觀孔隙互相連通，大小相仿，孔徑2?8μm。經(jīng)檢測(cè)，三維多孔β-磷酸三鈣支架總孔隙率檢測(cè)為

5、(61.76±2.53)%，其中宏觀孔隙率約為42.5%，微觀孔隙率為19.26%。RFP/PLGA微球呈現(xiàn)暗紅色；RFP/PLGA微球呈現(xiàn)白色。在RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球周圍有未能包封藥物的PLGA小微球存在。電子掃描顯微鏡觀察見微球形態(tài)呈球形，表面布滿規(guī)則的0.5μm?1.5μm大小的小孔，這些小孔是 RFP和INH釋放的通道。環(huán)境掃描電鏡觀察顯示該材料在支架區(qū)有微觀多孔隙結(jié)構(gòu)，微孔分布均勻，微觀孔隙互相連通，大小

6、相仿，孔徑2μm~8μm。該材料在負(fù)載藥物微球區(qū)，即支架網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的孔隙區(qū)，宏觀孔隙400μm，RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球直徑200μm~300μm，分布均勻，實(shí)心微球是RFP/PLGA微球，空心微球INH/PLGA微球。微球均勻的分布在β-TCP支架上，三維多孔β-TCP負(fù)載 RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球的總孔隙率經(jīng)檢測(cè)為(30.59±1.33)%。燒結(jié)后和原材料的β-TCP支架X射線衍射分析圖譜顯示，燒

7、結(jié)前后無相轉(zhuǎn)變。取燒結(jié)后的β-TCP支架通過抗壓強(qiáng)度測(cè)試，孔隙400μm的β-TCP支架承受抗壓能力最大，最大壓縮強(qiáng)度為(3.31±0.64)MPa，力學(xué)性能可以達(dá)到松質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度2-12 MPa。
　　二、多孔β-TCP支架負(fù)載抗結(jié)核藥物緩釋微球體外藥物釋放和降解
　　通過該復(fù)合材料體外釋放和降解實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證材料抗結(jié)核、成骨、降解吸收的匹配程度，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)果表明，RFP/PLGA和INH/PLGA微球的載藥

8、率分別為26.0±1.2%與28.0±1.5%；每個(gè)多孔β-TCP支架的質(zhì)量為401.0±13.2mg（n=10），β-TCP負(fù)載50%RFP/PLGA微球和50%INH/PLGA微球后，質(zhì)量約增加79.0±7.6mg，負(fù)載藥物21.33±2.34mg(RFP和INH總量)。該材料平穩(wěn)釋放藥物約90d。在體外降解過程中，材料質(zhì)量隨著時(shí)間變化而逐漸降低，在15周時(shí)，材料降解質(zhì)量趨于0。在降解過程中，材料的PH值逐步降低，然后在輕微升高。在

9、降解過程中多孔β-TCP支架負(fù)載RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球材料抗壓強(qiáng)度逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)材料在體外降解中抗壓強(qiáng)度變化較小，開始抗壓強(qiáng)度為3.31Mpa，第4周時(shí)為3.11 Mpa，第8周時(shí)為3.04 Mpa，第12周時(shí)為2.98 Mpa，第13周以后無法測(cè)定。
　　三、多孔β-TCP支架負(fù)載抗結(jié)核藥物緩釋微球體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　通過該實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)該材料的體外生物相容性和成骨性能。該復(fù)合材料和鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

10、共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在材料邊界細(xì)胞生長(zhǎng)密集，對(duì)照組24，48，72 h細(xì)胞生長(zhǎng)通過單位面積計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)組24，48，72 h細(xì)胞數(shù)量和陰性對(duì)照組無明顯差異，兩組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞之間距離均無明顯差異。通過金相顯微鏡觀察多孔β-TCP支架小梁的顯微結(jié)構(gòu)和共同培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察熒光染色后的細(xì)胞，細(xì)胞在多孔β-TCP支架小梁的分布呈簇?fù)頎?，可見?xì)胞生長(zhǎng)于多孔材料表面和孔隙中，有些已經(jīng)進(jìn)入支架內(nèi)部。掃描電鏡觀察可見在β-磷酸三鈣孔隙有大鼠

11、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形和不規(guī)則形，與材料表面黏附，在材料表面細(xì)胞貼壁、密集生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)活躍，并伸出偽足附著材料表面。
　　四、多孔β-TCP支架負(fù)載抗結(jié)核藥物緩釋微球的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　通過對(duì)三維多孔β-TCP支架負(fù)載RFP/PLGA緩釋微球和INH/PLGA緩釋微球材料的特性進(jìn)行了系列的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了多孔β-TCP支架負(fù)載抗結(jié)核緩釋微球材料具有良好的緩釋特性，三維多孔β-TCP骨組織工程支架有良好的充填骨缺損和促進(jìn)成

12、骨作用。對(duì)實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)抽樣進(jìn)行X線攝片，四組骨缺損修復(fù)的X線表現(xiàn)載藥組和未載藥組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。常規(guī)CT研究其體內(nèi)降解，結(jié)果和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。Micro-CT研究其新骨形成，結(jié)果顯示載藥組與未載藥組在術(shù)后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積無明顯差異（P＞0.05）；載藥組與對(duì)照組，未載藥組與對(duì)照組在術(shù)后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）；載藥組與空白組，未載藥組與空白組在術(shù)

13、后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）；對(duì)照組與空白組在術(shù)后3周、6周、9周、12周、15周的新骨體積有明顯差異（P＜0.05）。
　　以上結(jié)果說明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載復(fù)合抗結(jié)核緩釋藥物復(fù)合材料具有較強(qiáng)的抗結(jié)核和骨修復(fù)雙重作用，其組織相容性良好，降解吸收、成骨、藥物釋放等達(dá)到了完美匹配，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。提示其在未來臨床應(yīng)用中會(huì)發(fā)揮它抗結(jié)核和骨修復(fù)雙重作用，為結(jié)核性骨缺損修