海洋曲霉屬真菌次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的基因組挖掘與遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建.pdf

1、海洋微生物來源的天然產(chǎn)物因其獨特的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性而備受關(guān)注，特別是有研究證實海洋動植物體內(nèi)的微生物是其活性化合物的真正生產(chǎn)者。海蟑螂(Ligia oceanic)是中國南方沿海漁民治療跌打損傷常用的藥用動物，但目前對海蟑螂及其微生物的次級代謝產(chǎn)物（Secondary Metabolites，SMs）的研究較少，難以確認其藥用活性成分。
　　本研究以海蟑螂腸道內(nèi)海洋真菌Z5為研究對象，經(jīng)rDNA序列鑒定為曲霉屬菌株(Aspergi

2、llus sp.)。應(yīng)用二代高通量測序技術(shù)對該菌株進行全基因組測序分析及antiSMASH基因簇分析，結(jié)果顯示Z5菌株基因組大小為33.8Mbp，系統(tǒng)進化處于A.versicolor分支，共含有89個SMs生合成基因簇，結(jié)合One-Strain-Many-Compounds(OSMAC)結(jié)果說明:該菌具有合成多種SMs的潛能;全基因組挖掘的SMs基因簇數(shù)量遠超OSMAC分析的化合物數(shù)量，多數(shù)基因簇在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下為沉默狀態(tài)，如激活這些沉

3、默基因簇的表達，極可能獲得新型活性化合物。為開展該菌株的生物合成研究而獲得新型化合物，本研究構(gòu)建了Z5的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，探索優(yōu)化原生質(zhì)體制備純化方法，確定可通過β-巰基乙醇預(yù)處理及蔗糖分層純化法獲得再生率為94％的高質(zhì)量原生質(zhì)體，并應(yīng)用Double-Joint PCR替代傳統(tǒng)酶切連接法構(gòu)建基因盒，最終通過PEG/CaCl2轉(zhuǎn)化，獲得Z5的營養(yǎng)缺陷型菌株。
　　本研究為海洋真菌新型天然產(chǎn)物的獲得提供重要來源，為開發(fā)應(yīng)用該類真菌天然產(chǎn)物