蛋白質(zhì)Z在肺腺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是一種肺部組織內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)失控的疾病，其發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)很快。根據(jù)美國(guó)的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌目前是全球癌癥死因的第一名，約占全部惡性腫瘤的26％，對(duì)人群健康和生命威脅很大，尤其是肺腺癌初診時(shí)大多已是晚期，血行轉(zhuǎn)移較早，多伴血栓形成。肺癌的病因至今尚不完全明確。蛋白質(zhì)Z（Protein Z,PZ）作為蛋白質(zhì)Z依賴(lài)的蛋白酶抑制劑（Protein Z dependent protease inhibitor, ZPI）

2、的輔因子，主要在ZPI抑制FⅩa的過(guò)程中發(fā)揮間接抗凝作用，可以使ZPI對(duì)FⅩa的抑制作用增強(qiáng)1000倍以上。PZ缺乏時(shí)，抑制FXa作用下調(diào)，使凝血活性增強(qiáng)，從而可增加血栓形成的危險(xiǎn)性。
　　我們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)隨著惡性腫瘤病程進(jìn)展，PZ血漿水平明顯下降，這可能是惡性腫瘤高凝狀態(tài)形成的一個(gè)新的機(jī)制。最新的研究發(fā)現(xiàn)PZ可以在乳腺癌組織、肺癌組織、結(jié)腸癌組織和胃癌組織中過(guò)表達(dá)或合成，認(rèn)為PZ可能在腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮抗凝血作用，從而可能影響

3、到腫瘤的血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移。為了探索PZ在惡性腫瘤細(xì)胞的過(guò)表達(dá)除了可能與惡性腫瘤血栓形成有關(guān)外，是否也和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們選取了肺癌類(lèi)型中最易早期轉(zhuǎn)移及血栓形成的肺腺癌作為研究對(duì)象來(lái)研究這一問(wèn)題。
　　目的：
　　1.了解PZ蛋白及mRNA在肺腺癌的表達(dá)。
　　2.獲得 P Z蛋白在肺腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　3.探討PZ在肺腺癌發(fā)病、進(jìn)展、預(yù)后中的意義。
　　方法：

4、r>　　第一部分免疫組化方法檢測(cè)正常肺組織、肺腺癌組織PZ的表達(dá)
　　收集正常肺組織、肺腺癌組織、癌旁組織標(biāo)本后，免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)45例正常肺組織、45例肺腺癌組織及45例癌旁組織PZ的表達(dá)。完成統(tǒng)計(jì)分析，了解PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。
　　第二部分Western blot方法檢測(cè)肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)分2組，共45例癌旁組織和45例肺腺癌組織。每個(gè)樣品

5、收集完成后，液氮中浸置30分鐘，轉(zhuǎn)至-70℃冰箱保存。待全部樣品收集完成后，對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行裂解并用玻璃勻漿器勻漿，低溫超速離心提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步證實(shí)PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。
　　第三部分Western blot方法檢測(cè)正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白的表達(dá)
　　培養(yǎng)人正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基中和，轉(zhuǎn)

6、移至離心管，低溫超速離心后棄上清，PBS液清洗沉淀，RIPA裂解液裂解，充分裂解后，低溫超速離心提取細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，了解PZ蛋白是否在肺腺癌細(xì)胞高表達(dá)。
　　第四部分Real time-PCR方法檢測(cè)肺腺癌組織及癌旁組織的PZ mRNA表達(dá)情況
　　實(shí)驗(yàn)分2組，5例正常肺組織和5例肺腺癌組織。-70℃冰箱取出標(biāo)本，解凍，玻璃勻漿器勻漿，低溫超速離心提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一

7、步證實(shí)PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。
　　第五部分Real time-PCR方法檢測(cè)正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ基因mRNA的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)分2組：正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞。培養(yǎng)正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR儀檢測(cè)各細(xì)胞PZ基因mRNA的表達(dá)量，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，了解PZ mRNA在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

8、r>　　第一部分PZ在正常肺組織、肺腺癌組織、肺腺癌旁正常組織的表達(dá)
　　1.PZ在肺腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織和正常肺組織中不表達(dá)或低表達(dá)，PZ在巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）和新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells,ECs）中高表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)PZ表達(dá)積分隨腫瘤進(jìn)展明顯增高（P<0.05）；另外，低分化組同中高分化組比較得出PZ表達(dá)顯著升高，

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0005）；不同性別對(duì)比，PZ表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第二部分Western blot方法檢測(cè)肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達(dá)
　　同肺腺癌旁組織相比，肺腺癌組織中PZ表達(dá)明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0003）；早、中、晚各組相互對(duì)比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)PZ表達(dá)隨腫瘤進(jìn)展明顯增高（P<0.05）；此外，低分化組同中高分化組比較得出PZ表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0

10、.0005）；不同性別對(duì)比，PZ表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第三部分Western blot方法檢測(cè)正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白的表達(dá)
　　A549、212102、GLC-82及16-HBE-T中PZ蛋白的表達(dá)各有差異，經(jīng)半定量密度分析得出PZ表達(dá)在A549、GLC-82呈高表達(dá)，在A549尤為突出，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　第四部分肺腺癌組織和人正常肺組織PZ mRNA表達(dá)情況
　　分別檢測(cè)5例

11、肺腺癌組織和5例正常肺組織PZ基因和管家基因GADPH表達(dá)情況。由于樣本量不足，數(shù)據(jù)離散程度大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行檢測(cè)。（P>0.05）。
　　第五部分正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白及mRNA的表達(dá)情況
　　應(yīng)用熒光定量 PCR儀器 SYBR方法分別檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞 A549和正常細(xì)胞16-HBE PZ基因和管家基因GADPH表達(dá)情況，通過(guò)檢測(cè)得出，肺腺癌細(xì)胞A549 PZ基因 mRNA表達(dá)量與正常對(duì)

12、照組二者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.PZ蛋白在肺腺癌組中的表達(dá)明顯高于正常肺組織（癌旁組織），表明 PZ可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　2.PZ蛋白在中晚期組的表達(dá)明顯高于早期組，表明其表達(dá)可能與肺腺癌的分期相關(guān)，即肺腺癌越接近晚期，PZ蛋白表達(dá)可能越高。
　　3.PZ蛋白在低分化組的表達(dá)明顯高于中高分化組，表明其表達(dá)可能與肺腺癌的分化程度相關(guān)，即腫瘤的分化程度越低，PZ蛋白表達(dá)可能越高。<