中華鱘幾個生殖細胞相關(guān)基因的克隆和表達特征研究.pdf

1、中華鱘(Acipense sinensis)為瀕危物種,國家一級保護動物;其性成熟期長達10年以上,且發(fā)育不同步。雖然其全人工繁殖于2009年已實現(xiàn),但此種方法需要對其親本長期養(yǎng)殖,需要投入大量的人力、物力和財力,而且還存在親魚死亡等多種風險,因此,有必要尋求其他辦法對該物種進行多途徑的保護。近年來隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,生殖細胞移植被認為是一種周期短而且有效的方法,在魚類中有成功應用的報道。該種方法的實施需要首先找到生殖細胞的標記基因

2、。另外,到目前為止,關(guān)于中華鱘性別分化、生殖調(diào)控的分子機制的相關(guān)信息,依然十分有限。鑒于此,本研究通過同源克隆的方法,在中華鱘中得到4個已知在生殖細胞或/和生殖干細胞中起重要作用的基因(pou2、nanos1、dazl和boule)的全長cDNA序列;運用RT-PCR技術(shù),研究它們在中華鱘不同組織和/或不同胚胎發(fā)育時期和/或不同年齡性腺中的表達特征。另外,將中華鱘nanos1基因進行原核表達,制備多克隆抗體,運用Western Blot

3、研究中華鱘Nanos1蛋白在不同組織中的表達;通過免疫熒光定位,研究中華鱘Nanos1蛋白在性腺中細胞的表達部位。主要研究結(jié)果如下:
　　1.脊椎動物中,第Ⅴ類POU基因家族成員包括:pou5f1和pou2,其編碼的產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子起著維持胚胎干細胞和生殖干細胞多能性的作用。中華鱘pou2基因(Aspou2)的全長cDNA序列為2853 bp,其中開放閱讀框為1296 bp,編碼431個氨基酸,5’非編碼區(qū)為489 bp

4、,3’非編碼區(qū)為1068 bp。通過將AsPou2與其他物種第Ⅴ類POU家族基因氨基酸序列的多重比對,發(fā)現(xiàn)第Ⅴ類POU家族成員均含有一個非常保守的POU結(jié)構(gòu)域。AsPou2 POU結(jié)構(gòu)域與青鳉的氨基酸序列一致性最高,達到了90％,其次為斑馬魚(88%),爪蟾(69%),小鼠(67%)和人類(67%)。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),除肝臟外,Aspou2 mRNA在脾臟、心臟、卵巢、脂肪、腎臟、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦都表達

5、,而在肌肉、垂體和腦中的表達量較高。Aspou2為母源表達,且在胚胎發(fā)育過程中,其表達量逐漸降低,出膜后一天不表達。另外,還發(fā)現(xiàn)隨著性腺的發(fā)育,Aspou2的表達量增加。這些結(jié)果表明Aspou2可能在體細胞、多能干細胞、胚胎和性腺發(fā)育的過程中扮演著重要的角色。
　　2. nanos基因家族成員在種系細胞發(fā)育過程中起著重要的作用。本研究通過同源克隆的方法,得到了中華鱘nanos1基因(Asnanos1)的全長cDNA序列。該序列為7

6、75 bp,開放閱讀框為為687 bp,編碼228個氨基酸,5’非編碼區(qū)長88 bp,沒有發(fā)現(xiàn)3’非編碼區(qū)。通過同源比對發(fā)現(xiàn),AsNanos1有一個非常保守的鋅指結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),除脂肪外,Asnanos1 mRNA在脾、心、卵巢、肝、腎、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦中有表達。另外,將AsNanos1原核表達,獲得純化的重組蛋白,免疫家兔,成功制備有效的多克隆抗體。Western Blot分析發(fā)現(xiàn),除脂肪、

7、肌肉和腸外,AsNanos1蛋白在脾、心、卵巢、肝、腎、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦都表達。這與其mRNA在組織中的表達模式不一致。隨后,通過免疫熒光定位,發(fā)現(xiàn)AsNanos1在初級卵母細胞和精母細胞的細胞質(zhì)中表達,并且隨著卵巢的發(fā)育,其分布在整個初級卵母細胞的細胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明,對于Asnanos1的定位以及與其他因子的相互作用,可能存在著另外的一種機制。同時,不同物種之間nanos1 mRNA表達特征具有保守性和差異性。

8、另外,AsNanos1可能在生殖細胞的發(fā)育過程中起作用,同時也可以作為中華鱘初級卵母細胞和精母細胞的標記基因。
　　3. DAZ家族基因為在性腺特異表達,作為多種生物的生殖細胞標記基因。在中華鱘中,克隆得到了dazl和boule的同源基因,即Asdazl和Asboule,并且發(fā)現(xiàn)Asboule至少存在10個亞型。Asdazl全長cDNA序列為2337 bp,開放閱讀框為為675 bp,編碼224個氨基酸,5’非編碼區(qū)為126 bp

9、,3’非編碼區(qū)為1536 bp;Asboule1全長cDNA序列為2572 bp,開放閱讀框為為1062 bp,編碼353個氨基酸,5’非編碼區(qū)為157 bp,3’非編碼區(qū)為1353 bp。結(jié)構(gòu)域分析表明,AsDazl和AsBoule1都含有兩個保守的結(jié)構(gòu)域,即RNA Recognition Motif和DAZ-repeat。同源性分析發(fā)現(xiàn),AsDazl與其他魚類的氨基酸序列的一致性為60%左右,而與其他脊椎動物 Dazl氨基酸的相似性

10、較低,只有40%左右;但是，AsBoule1與哺乳類氨基酸序列的一致性為60%左右,而與其他脊椎動物和無脊椎動物的相似性很低,只有20%~30%左右,如青鳉(31%);另外,中華鱘AsDazl和AsBoule1的氨基酸序列一致性只有25%。不同亞型Asboule的分析和基因組擴增結(jié)果表明,其在轉(zhuǎn)錄過程中存在選擇性剪切,而且至少存在著兩個基因拷貝。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),Asdazl和Asboule1都只在性腺中表達,而且Asdazl mR