USP18-SOCS1在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干擾素中的作用及其分子機制研究.pdf

1、背景:
　　全球約1.5億人感染HCV，并且部分患者會發(fā)展成慢性感染進而引發(fā)肝硬化及肝癌等疾病，嚴重危害人類健康。目前，長效干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療慢性丙型肝炎的標準治療方案。但是，由于IFN-α受體在體內(nèi)廣泛分布而引發(fā)一系列不良反應，加之耐藥性的存在，嚴重阻礙了它的臨床應用。新的IFN家族——Ⅲ型干擾素(IFN-λ)，具有有限的受體分布且相同的抗病毒作用，成為替代IFN-α用于臨床治療HCV慢性感染者的新希望。
　　干擾素

2、刺激基因是IFN信號傳導通路中發(fā)揮抗病毒作用的終極武器，但是同時也是一把雙刃劍。ISG中存在一類負調(diào)控因子（包括USP18和SOCS1），他們阻斷干擾素信號通路的傳導形成負反饋調(diào)節(jié)，這也是造成HCV對IFN治療耐受的原因之一。USP18(Ubiquitin specific protease18)是一種泛素特異性蛋白，它可以通過與IFNAR2受體結(jié)合阻斷Ⅰ型干擾素信號通路的傳導，而對于Ⅲ型干擾素信號通路的影響還是個未知數(shù)。同時，細胞因子

3、信號傳導抑制分子1(Suppressor of cytokinesignaling1，SOCS1)作為干擾素內(nèi)源性抑制物，可以與Tyk2相互作用從而阻斷干擾素信號通路，抑制干擾素抗病毒活性導致HCV持續(xù)感染。而SOCS1在HCV的入胞和分泌過程中的作用還鮮有報道。
　　多項研究表明（包括本課題組前期研究），肝組織內(nèi)ISG差異表達與治療療效密切相關。此外，外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear ce

4、lls，PBMCs）有可能替代肝穿樣本用于療效預測的檢測。考慮到目前干擾素治療HCV感染療效不理想及廣泛的不良反應，揭示HCV耐藥的分子機制和建立高效的療效預測手段是HCV科研領域兩個亟待解決的關鍵問題。本研究立足于探討負調(diào)控因子(USP18和SOCS1)在HCV耐受干擾素中的作用機制。
　　目的:
　　1、研究IFN-α和IFN-λ激活Jak/STAT及ISG表達的時間效應曲線的差異;
　　2、驗證高表達USP18/

5、SOCS1對IFN-α和IFN-λ信號傳導通路的調(diào)控和抗HCV活性的影響及在HCV病毒生活史中的作用（入胞、復制和分泌）;
　　3、探討慢性丙肝病人PBMC中相關基因的表達水平差異與治療療效的相關性。
　　方法:
　　1、將pCR3.1/SOCS1和pCR3.1/USP18真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Huh7.5.1細胞中，通過Realtime PCR和Western blot檢測目標基因的表達情況從而優(yōu)化最適表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量，

6、轉(zhuǎn)染試劑使用量及IFN濃度。給予IFN-α和IFN-λ刺激后，不同時間點取樣，Realtime PCR測定ISG時間效應曲線以及高表達USP18/SOCS1對于時間效應曲線的影響。
　　2、將pCR3.1/USP18和pCR3.1/SOCS1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入復制子細胞Con1b、JFH1-2a及HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過雙熒光報告基因系統(tǒng)、Realtime PCR和Western blot檢測高表達USP18/SOCS1對IFN

7、信號通路中P-STAT1磷酸化水平、ISRE活性及ISG表達水平的影響及HCV RNA復制水平的影響。在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中高表達USP18/SOCS1，收集上清液，通過測定TCID50明確高表達USP18或SOCS1對HCV分泌的影響;提取胞內(nèi)RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過Realtime PCR檢測USP18或SOCS1高表達對HCV受體的調(diào)控及HCV RNA復制水平的影響從而確定其對HCV入胞的影響。
　　3、從48個治療后的HC

8、V慢性患者中提取PBMC，體外培養(yǎng)8h并同時給予IFN-α刺激，將未經(jīng)IFN-α刺激的體外培養(yǎng)PBMC作為陰性對照，通過Realtime PCR檢測相關基因的轉(zhuǎn)錄水平變化并確定其與治療療效的相關性。
　　結(jié)果:
　　1、使用最適轉(zhuǎn)染體系及最佳IFN工作濃度，我們確認兩種干擾素(IFN-α/IFN-λ)誘導ISGs(ISG15/MxA)的時間效應曲線具有明顯差異:IFN-α誘導下ISG表達的時間效應曲線峰值出現(xiàn)快且持續(xù)時間短，

9、而IFN-λ誘導下ISG表達的時間效應曲線峰值出現(xiàn)慢且持續(xù)時間長;而由這兩種干擾素誘導產(chǎn)生的負調(diào)控因子(USP18/SOCS1)表達的時間效應曲線正好與之相反。提示干擾素信號傳導通路中兩個主要的負調(diào)控因子SOCS1及USP18是導致Ⅰ型和Ⅲ型干擾素激活Jak/STAT刺激ISG表達的時間動力學差異的主要原因。
　　2、高表達USP18/SOCS1在HCV復制子細胞(Con1b和JFH1-2a)中，可以通過下調(diào)P-STAT磷酸化水平

10、、減弱ISRE活性及降低ISG表達水平從而全面阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號通路。此外，在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中也表明，由它們所介導的這種對干擾素信號傳導通路的抑制作用顯著地促進了HCV的復制水平，并且高表達USP18顯著上調(diào)了HCV受體LDLR和SR-BI的轉(zhuǎn)錄水平從而促進了HCV病毒的入胞，而高表達SOCS1雖然顯著上調(diào)了HCV受體LDLR的轉(zhuǎn)錄水平但對 HCV病毒的入胞無影響。此外這兩種負調(diào)控因子對于HCV分泌均無影響。

11、　　3、本實驗對PBMC中部分基因的表達變化與干擾素治療HCV療效相關性進行了初步探討，我們明確了MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在干擾素治療無應答組的本底水平高表達，而USP18和ISG15在治療有應答與無應答不同組中本底水平的表達無差異。
　　結(jié)論:
　　1、證明負調(diào)控因子(USP18/SOCS1)的表達差異是造成IFN-α和IFN-λ激活干擾素信號傳導通路誘導抗病毒ISG(ISG15/MxA)時間效應曲線差

12、異的主要原因，可能也是造成IFN耐受的原因之一。
　　2、高表達USP18/SOCS1可以阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號通路而顯著促進HCV病毒復制，其中，高表達USP18可以上調(diào)HCV入胞受體水平而有利于病毒入胞。促進HCV入胞、刺激HCV RNA復制及全面抑制干擾素信號傳導通路也許是HCV耐受干擾素導致治療失敗的重要原因。
　　3、明確HCV慢性患者PBMC中MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在本底水平的高表達