基于細(xì)胞壁多糖糖譜的黃芪種質(zhì)資源鑒別及阿拉伯木聚糖制備研究.pdf

1、選題依據(jù)：黃芪，作為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥材之一，在醫(yī)藥、保健品、食品和營(yíng)養(yǎng)品領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)生長(zhǎng)年限和生長(zhǎng)環(huán)境的不同，黃芪可以分為傳統(tǒng)黃芪（野生黃芪和半野生黃芪）和速生黃芪(育苗移栽種植)。目前評(píng)價(jià)黃芪品質(zhì)的指標(biāo)是黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃芪等級(jí)增高、生長(zhǎng)年限增加，黃芪甲苷含量反而降低，其中速生芪的含量最高。以上表明，若依據(jù)目前黃芪品質(zhì)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，速生芪的品質(zhì)反比傳統(tǒng)芪高。然而，國(guó)內(nèi)老中醫(yī)和國(guó)際市場(chǎng)卻只認(rèn)可傳統(tǒng)芪

2、，這些矛盾有效地說(shuō)明了目前黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)存在不足。因此我們需要探尋和建立更加合理的評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而達(dá)到保護(hù)和發(fā)展傳統(tǒng)黃芪的目的。
　　多糖作為黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)，應(yīng)該作為評(píng)價(jià)黃芪品質(zhì)的指標(biāo)。但目前研究者多利用紫外分光光度法來(lái)測(cè)定總多糖的含量，這種方法專(zhuān)屬性低，限制了中國(guó)藥典對(duì)該指標(biāo)的收載。糖譜技術(shù)與肽譜技術(shù)相類(lèi)似，是基于糖類(lèi)化合物的水解而發(fā)展形成的一種新型的分析方法。該方法不僅操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)成本低，而且不同來(lái)源多糖可

3、形成專(zhuān)一性的糖譜，可用于多糖的定性、定量分析，還可用于物種的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。其中，植物細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分是多糖類(lèi)化合物，包括果膠和半纖維素等。不同植物中該類(lèi)成分的組成和結(jié)構(gòu)具有顯著差別。因此，我們期望能夠利用糖譜技術(shù)，建立黃芪細(xì)胞壁多糖的糖譜組，從中找出不同種屬、不同生長(zhǎng)方式黃芪的差異多糖組分，并將該組分作為鑒別和評(píng)價(jià)不同種屬、不同生長(zhǎng)方式黃芪的質(zhì)控指標(biāo)。
　　中藥藥渣是中藥提取后的廢棄物，現(xiàn)代研究已證實(shí)多種活性多糖蘊(yùn)含在植物細(xì)

4、胞壁組分中。其中，半纖維素含有活性多糖的種類(lèi)最為豐富，被稱(chēng)為潛在的“藥物資源庫(kù)”。本課題組前期在黃芪細(xì)胞壁多糖指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪半纖維素多糖主要成分為阿拉伯木聚糖（AXs），已有研究報(bào)道該聚糖具有顯著的抗腫瘤活性，因此本課題組希望通過(guò)建立黃芪細(xì)胞壁阿拉伯木聚糖的提取分離方法，再進(jìn)行結(jié)構(gòu)及藥理活性研究，為研發(fā)出輔助治療腫瘤的藥物提供基礎(chǔ)。
　　目的：通過(guò)對(duì)黃芪細(xì)胞壁多糖糖譜的研究，找到鑒別不同種屬、不同生長(zhǎng)方式黃芪的差異指標(biāo)，

5、以及優(yōu)選黃芪藥渣細(xì)胞壁中阿拉伯木聚糖的提取分離方法，并初步確定結(jié)構(gòu)。
　　方法：采用分級(jí)堿提法獲得細(xì)胞壁中果膠和半纖維素多糖，經(jīng)過(guò)TFA水解、乙?；螅肎C-MS儀進(jìn)行單糖定性定量分析，然后結(jié)合數(shù)據(jù)主成分分析、聚類(lèi)分析等方法，找出不同生長(zhǎng)方式黃芪細(xì)胞壁中的差異性糖類(lèi)成分，進(jìn)一步對(duì)差異性糖類(lèi)成分進(jìn)行篩選和分析；運(yùn)用兩種不同的方法（離子液體提取法和傳統(tǒng)堿提法）提取黃芪藥渣中AXs，并對(duì)其得率、含量、相對(duì)分子量和單糖組成進(jìn)行了比較；

6、然后通過(guò)采用分級(jí)堿提法，依次除去黃芪藥渣中的木質(zhì)素、果膠和纖維素，獲得黃芪藥渣中的AXs。采用DEAE-纖維素52陰離子交換柱層析和Sephacryl S-400 HR凝膠柱對(duì)獲得的AXs進(jìn)行分離純化。對(duì)粗多糖的總糖含量、相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成進(jìn)行分析，對(duì)純化后的AX-a-1和AX-a-2采用單糖組成、甲基化和紅外光譜(IR)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。
　　結(jié)果：1.通過(guò)測(cè)定24批不同生長(zhǎng)方式黃芪樣品中細(xì)胞壁果膠（A-1和A-2組分）和半

7、纖維素（B-1和B-2組分）的中性單糖組成及含量，發(fā)現(xiàn)這些化合物中糖類(lèi)成分主要由Mannose、Arabinose、Xylose、 Rhamnose、Galactose、Glucose和Fucose構(gòu)成。對(duì)黃芪細(xì)胞壁的單糖指紋譜圖進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)芪與速生芪有很好的分離結(jié)果。將果膠組分的Arabinose的物質(zhì)的量為1mol，求半纖維素組分的Arabinose的摩爾比，發(fā)現(xiàn)速生芪中半纖維素組分Arabinose：果膠組分Arabi

8、nose的比值大于0.5:1，傳統(tǒng)芪中半纖維素組分Arabinose：果膠組分Arabinose的比值小于0.5:1。對(duì)黃芪細(xì)胞壁的單糖指紋譜圖進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)芪與速生芪可以分別聚為一類(lèi)，結(jié)果與主成分分析一致。對(duì)黃芪細(xì)胞壁的單糖指紋譜圖進(jìn)行相似度分析發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)方式相同的黃芪相似度系數(shù)>0.9，生長(zhǎng)方式不同的黃芪相似度系數(shù)<0.7，且不同種屬間的黃芪中細(xì)胞壁單糖指紋圖譜的相似度系數(shù)均高于不同生長(zhǎng)方式的黃芪中細(xì)胞壁單糖指紋圖譜的相似度

9、系數(shù)，綜上反映出不同生長(zhǎng)方式的黃芪細(xì)胞壁中糖類(lèi)成分差異較大，與上述結(jié)果一致。
　　2.通過(guò)比較不同離子液體、不同提取溫度和不同提取時(shí)間對(duì)黃芪藥渣中AXs的得率和含量的影響，篩選出離子液體提取黃芪藥渣中AXs的最佳條件為：1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽離子為提取溶劑，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為24h。通過(guò)比較離子液體提取法和傳統(tǒng)堿提法得到的AXs的得率、含量、相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成，發(fā)現(xiàn)兩種方法各有優(yōu)劣。
　　3.從黃芪藥渣中

10、經(jīng)1mol/L KOH和4mol/LKOH堿提獲得的AX-a和AX-b均為雜多糖，進(jìn)一步分離純化得到了9種水溶性多糖組分。對(duì)其中AX-a-1和AX-a-2采用高效液相凝膠色譜法測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量分別為34.158KDa和10.425KDa。結(jié)構(gòu)分析表明，AX-a-1和AX-a-2均是β－吡喃型雜多糖，單糖組成為Rha、Ara、Xyl、Man、Glc和Gal，其比例分別為0.01:14.11:8.28:0.12:0.47:1和0.67:5

11、3.36:17.56:0.20:0.21:1，其高度分支化，含有的連接方式分別為 L-Rhap-(1→，→3,4)-L-Arap-(1→，→2,3,4)-D-Xylp-(1→，→2)-D- Manp-(1→， D-Glcp-(1→，2,3,6→)-D-Glcp-(1→，→2,3)-D-Galp-(1→和→2)-D-Galp-(1→；3,4→)- L-Rhap-(1→， L-Araf-(1→，→4)-L-Arap-(1→，→3,4)-L-

12、Arap-(1→，→2,4)-L-Arap-(1→， D-Xylp-(1→，→2,3,4)-D-Xylp-(1→，→4)-D-Manp-(1→，2.3→)-D-Glcp-(1→，D-Galp-(1→，和→6)-D-Galp-(1→。
　　結(jié)論：1.黃芪細(xì)胞壁的多糖糖譜技術(shù)是一種方便快捷、準(zhǔn)確度高的多糖鑒別和質(zhì)量控制的新方法，可以用于鑒別傳統(tǒng)黃芪與速生黃芪，通過(guò)求算相似度系數(shù)和細(xì)胞壁中果膠與半纖維素中Arabinose的摩爾比值，即