釀酒酵母木糖和阿拉伯糖代謝途徑的表達.pdf

1、傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵主要以糧食作物原料，但為了節(jié)約成本，利用以木質(zhì)纖維素為主的可再生生物質(zhì)資源，充分將其中可利用成分轉(zhuǎn)化為燃料乙醇具有重要的經(jīng)濟與社會意義。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其中木糖是半纖維素的主要組成單糖。然而，傳統(tǒng)的用于乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的釀酒酵母，能很好地利用葡萄糖，卻不能利用木糖和阿拉伯糖，可以說戊糖的有效利用是生物質(zhì)資源成功工業(yè)化轉(zhuǎn)化的必要基礎(chǔ)。因此，向釀酒酵母中引入戊糖代謝途徑使其共發(fā)酵己糖和戊糖是研究的重點

2、。本工作以高效復(fù)制整合質(zhì)粒，最優(yōu)啟動子及最優(yōu)戊糖代謝基因為策略展開實驗，向釀酒酵母中引物戊糖代謝途徑，構(gòu)建了能利用木糖和阿拉伯糖的工程菌株。
　　對自主復(fù)制區(qū)（Autonomously Replicating Sequence，ARS）的研究，向釀酒酵母整合載體pNTS2K中引入4種ARS（ARS304, ARS315,ARS735,ARS1512），經(jīng)電轉(zhuǎn)化后，證實了四種復(fù)制區(qū)都能在釀酒酵母中獨立自主復(fù)制且ARS315復(fù)制能力最

3、強。因此，ARS315可用于構(gòu)建高拷貝且穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，為構(gòu)建高表達且穩(wěn)定的工程酵母菌株奠定了基礎(chǔ)。
　　對最優(yōu)啟動子的研究，以實驗室保存的三種釀酒酵母表達質(zhì)粒（pJFE11, pPY1, pTP2）為骨架，構(gòu)建了以三種組成型啟動子（TEF1p，PGK1p，TDH3p）啟動木糖異構(gòu)酶基因（xylA）的表達質(zhì)粒。通過比較三種組成型啟動子（TEF1 p，PGK1p， TDH3p）啟動木糖異構(gòu)酶的表達情況，從轉(zhuǎn)化子生長，木糖消耗，乙醇生

4、產(chǎn)三種情況初步確定了啟動子PGK1p更適合于本宿主表達木糖異構(gòu)酶，利用木糖生產(chǎn)乙醇。這為后期工業(yè)釀酒酵母整合表達木糖異構(gòu)酶奠定了基礎(chǔ)。
　　阿拉伯糖代謝途徑表達方式的研究，通過不同的方式在釀酒酵母中共表達了植物乳桿菌L-阿拉伯糖代謝途徑的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因（araA），L-核酮糖激酶基因（araB），L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶基因（araD）。比較了三種共表達方式，多基因，多啟動子，多質(zhì)粒共表達；多基因，多啟動子，單

5、一質(zhì)粒共表達；多基因，單啟動子，單一質(zhì)粒共表達；發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌 L-阿拉伯糖代謝途徑的基因 araA， araB，araD在單啟動子TEF1p作用共表達效果較好。而且這種單啟動中表達框相對于其他多表達框更易于整合酵母染色體。因此，這種表達方式為后期整合表達奠定了基礎(chǔ)。
　　釀酒酵母木糖、阿拉伯糖利用的工程菌株的構(gòu)建，利用釀酒酵母Juk36a作為宿主菌，以ARS315作為復(fù)制區(qū)的復(fù)制整合型質(zhì)粒pNTS2KA為骨架，同時引入了以PGK

6、1p為啟動子表達木糖異構(gòu)酶基因 BvuxylA的木糖代謝途徑和以單啟動子TEF1p啟動基因araA，araB，araD的阿拉伯糖代謝途徑，獲得了一株能高效利用木糖，阿拉伯糖的工程菌株36aS1。36aS1在木糖合成培養(yǎng)基中最大生長速率為0.32 h-1，在阿拉伯糖合成培養(yǎng)基中生長速率為0.22 h-1。在葡萄糖和木糖共發(fā)酵情況下，48 h就能完全消耗180g/L的糖產(chǎn)生高達75g/L的乙醇，且?guī)缀鯚o木糖醇及乙酸等副產(chǎn)物產(chǎn)生。乙醇產(chǎn)率為0