轉(zhuǎn)染TIMP-1-shRNA基因的骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠肝纖維化.pdf

1、【研究背景及目的】
　　慢性肝病發(fā)展惡化變成肝硬化，需經(jīng)共同路徑-肝纖維化（hepatic fibrosis），在此過程中細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）不正常沉積是主要的病理特征。肝纖維化的病理改變具有可逆性和動態(tài)性，但是肝硬化不能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn)。所以對于慢性肝病的防治，重點在于明確肝纖維化的發(fā)病機制，阻斷、抑制及逆轉(zhuǎn)肝纖維化。
　　干細胞在一定的內(nèi)環(huán)境下能夠定向分化為類肝細胞，分泌相關(guān)細胞因子，

2、促進受損肝臟的修復和再生。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干細胞家族的重要成員，具有低免疫原性和多向分化潛能等特性，是目前研究范圍最為廣泛的一種成體干細胞。
　　最近幾年，骨髓間充質(zhì)干細胞移植在逆轉(zhuǎn)肝纖維化方面的作用已經(jīng)得到證實，有望成為肝纖維化治療的新方法。雖然目前存在研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)組織損傷時多種干細胞會受骨髓的作用移動到發(fā)病部位，然后進行自然性、代償性地

3、修復；但是干細胞移植治療肝纖維化的療效仍不確切，其中重要的原因之一是干細胞靜脈途徑移植后，干細胞很難得到出色的歸巢或移行效果，從而影響干細胞的移植治療，導致療效較差。因此，要提升干細胞移植的治療效果，需要進一步提升移植干細胞的“質(zhì)量”。越來越多的研究把基因治療的方法和干細胞移植結(jié)合起來以提高治療的精準度。
　　基因治療是一種新型的治療手段，它的特點是在靶細胞的染色質(zhì)基因組內(nèi)導入正常與野生型的基因，將致病基因置換，或者將缺失基因補償

4、，最終得到新的表型。RNA干擾(RNA interference，RNAi)的特點是通過內(nèi)、外源性雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)進行誘導，使基因沉默在mRNA的水平上產(chǎn)生，它的特異性較強。小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)具有特異性與高效性，現(xiàn)階段在基因組功能實驗的過程中，它被應用的頻率較高。siRNA和以前常用的基因抑制工具的不同點在于，siRNA對基因表達的抑

5、制水平與效果更好、更持久，穩(wěn)定性更出色，得到的基因序列具有更高的特異性。RNAi這項新型技術(shù)可用于特定基因功能的抑制過程中，在生物體特征改善、藥品研究、基因治療及基因組功能研究等方面均可發(fā)揮重要的作用。RNAi可由慢病毒載體、質(zhì)粒介導，前者可以感染類型更多樣的細胞，獲得更出色的沉默效果，得到更高的轉(zhuǎn)染率，并且利用染色體整合使沉默效果更加穩(wěn)定與持久，所以在基因治療與基因表達調(diào)控等方面，它的應用頻率更高。小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA（a small

6、 hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA）是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)（tighthairpin turn）的RNA序列，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達。利用載體把shRNA導入細胞，載體中的U6啟動子確保shRNA總是表達；這種裝載了shRNA載體可被傳遞到子代細胞中去，從而使基因的沉默可被遺傳。shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細胞機制切割成siRNA，然后siRNA結(jié)合到RNA誘導沉默復合物上（RNA-in

7、duced silencing complex，RISC），該復合物能夠結(jié)合到目的mRNAs并將其降解，起到基因沉默的作用。
　　干細胞之所以能夠在循環(huán)后在內(nèi)皮細胞表面黏附，是病變處表達的粘附因子起到了介導作用，接著趨化因子發(fā)揮作用，使干細胞通過內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移至相關(guān)組織內(nèi)，最后到達病變部位開始分化與增殖過程。各種自然障礙會在干細胞歸巢時相遇，例如基底膜與間質(zhì)結(jié)締組織之間的ECM。干細胞想要通過EMC，必須借助于某些酶的作用，這些酶可

8、以對ECM的構(gòu)成成分進行降解。所以干細胞生成與分泌的蛋白酶類型與機理是干細胞研究的關(guān)鍵。對于ECM的特異性降解，可以發(fā)揮作用的酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及絲氨酸蛋白酶。最近幾年的研究結(jié)果顯示基質(zhì)金屬酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)能夠降解ECM，而體內(nèi)天然存在的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalprotease，TIMPs)則可對MMPs的活性

9、進行抑制。
　　相關(guān)結(jié)果顯示干細胞穿過基底膜的能力可以通過TIMP-2、MTI-MMP、MMP-2的穩(wěn)定表達而得到加強，MMP-9不會被干細胞表達，即便被表達，表達量也很低，但是在干細胞的轉(zhuǎn)移與歸巢過程中MMP-9發(fā)揮了一定的作用。TIMP-1與TIMP-2的作用有著顯著差異，如果TIMP-1的表達時間長、表達量高，那么干細胞穿過基底膜的能力會受到抑制，這是因為MMP-9的活性受到了抑制。因此，我們設想通過沉默TIMP-1，上調(diào)M

10、MPs的表達增強干細胞穿過基底膜的能力，促進干細胞歸巢到纖維化肝臟組織，提高肝纖維化的治療療效。
　　本實驗在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中轉(zhuǎn)染了攜帶有TIMP-1-shRNA的基因，靜脈移植治療大鼠肝纖維化模型，對轉(zhuǎn)染攜帶有TIMP-1-shRNA基因的BMSCS之后觀察肝功能是否得到改善、肝纖維化是否得到抑制，設想是體內(nèi)增加了骨髓干細胞歸巢于纖維化肝臟的數(shù)量所致，從而對聯(lián)合應用RNA干擾技術(shù)與干細胞移植技術(shù)在治療肝纖維化中的應用前景進

11、行探究，為在更深層次研究干細胞歸巢機制打下基礎，并進一步探討干細胞聯(lián)合RNA干擾治療肝纖維化的機理。
　　【實驗方法】
　　1、全骨髓法（貼壁篩選法）進行大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠的骨髓MSCs分離純化后，取培養(yǎng)的第二代BMSCs，分別加入下列羊抗鼠單克隆抗體：CD34-FITC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、HLA-Dr-PE，置4℃孵30分鐘，PBS洗2次，進行流式細胞儀分析

12、及細胞周期檢測；收集培養(yǎng)第三代BMSCs，行成骨鑒定等間充質(zhì)干細胞生物學特性鑒定。
　　2、建立沉默TIMP-1基因的BMSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
　　設計、合成3對針對TIMP-1基因的特異性shRNA片段，在293T細胞中轉(zhuǎn)染測序準確的慢病毒與載體質(zhì)粒包裝得到的質(zhì)粒，收集、純化和濃縮富含慢病毒的細胞上清液。使用慢病毒包裝系統(tǒng)來沉默具有TIMP-1基因不同位點的3組骨髓間充質(zhì)干細胞株（SH1、SH2、SH3組），同時設立轉(zhuǎn)染

13、空載體組，對每組細胞轉(zhuǎn)染先后細胞形態(tài)與熒光的表達量進行觀測。再抽提蛋白，通過Western blot技術(shù)對TIMP-1蛋白的表達量進行檢測。
　　3、制備CCl4損傷大鼠肝纖維化模型
　　本課題組隨機將40只SD大鼠40只，體重200-300g，雄性大鼠，分為模型組（n=36）和正常對照組（n=4），模型組腹腔注射CCl4(1μl/g，橄欖油1:1稀釋)，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每周2次，連續(xù)4周，制備大鼠肝纖維化

14、模型。
　　4、靜脈注射轉(zhuǎn)染基因治療大鼠肝纖維化肝纖維化模型組第5周隨機分為3組，每組12只，BMSCs組（通過鼠尾靜脈注射3×106個大鼠BMSCs細胞），TIMP-1-shRNA-BMSCs組（通過鼠尾靜脈注射3×106個攜帶TIMP-1-shRNA病毒載體感染的大鼠BMSCs細胞），空白組（通過鼠尾靜脈注射生理鹽水200μl）。在4周移植之后將全部實驗動物處死：將實驗組肝臟提取出來進行冰凍切片，GFP標記陽性表達細胞在肝內(nèi)的

15、分布通過熒光顯微鏡觀察；取各組大鼠肝臟做石蠟切片，HE染色檢測肝纖維化情況；免疫組織化學檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原在移植前后肝臟中的表達；肝功能指標檢查：將全部動物的血清回收，通過全自動生化儀進行觀測，分析AST、ALT等肝功指標的情況，從而評價轉(zhuǎn)染TIMP-1-shRNA的BMSCs治療大鼠肝纖維化的效果。
　　【實驗結(jié)果】
　　1、全骨髓法（貼壁篩選法）進行大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　原代培養(yǎng)7天的大鼠BMSCs貼

16、壁生長，折光性強，細胞呈梭形、三角形和多角形。2周時細胞生長可達80％融合，細胞為大梭形，排列緊密并有一定的方向性，呈成纖維細胞樣分布。傳代培養(yǎng)后細胞生長速度明顯加快，接種3小時后即可出現(xiàn)貼壁。傳代培養(yǎng)3天后逐漸形成扁平單層細胞，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細胞密度的增加，胞體變得細長，形態(tài)類似成纖維細胞。第5天可達到90%融合，細胞形態(tài)呈相對均勻一致的長梭形且胞漿豐富、折光度好，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細胞密度的增加，胞體變得細長

17、，形態(tài)類似成纖維細胞。流式細胞儀檢測顯示，BMSCs表達CD90、CD73、CD105和CD166，不表達CD34、CD45、CD14、CD106和HLA-Dr。流式細胞儀結(jié)果顯示，第2代MSCs中G0/G1期的細胞為94.1％，G2期的細胞為4.9％，S期的細胞為1.0％，大部分細胞處于靜止期，只有少數(shù)的細胞處于活躍的增殖期符合干細胞特征。細胞生物學特性檢測，具有成骨細胞、成脂細胞及軟骨細胞的多向分化潛能，符合骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特

18、性。
　　2.建立沉默TIMP-1基因的BMSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs1周后，每組內(nèi)均被觀察到強熒光，轉(zhuǎn)染前后細胞形態(tài)無改變。免疫印跡技術(shù)分析蛋白表達，結(jié)果表明在3個實驗組中，SH3組TIMP-1蛋白表達最低。
　　3、制備CCl4損傷大鼠肝纖維化模型
　　肝組織蘇木精-伊紅染色顯示：正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥壞死及纖維化；CCl4注射4周可見纖維結(jié)締組織大量增生，形成廣泛纖維間隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，

19、假小葉形成。4、靜脈注射轉(zhuǎn)染基因治療大鼠肝纖維化
　　組織學檢測結(jié)果：肝組織切片中，空白組大鼠肝內(nèi)膠原纖維在匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)增生明顯，并向肝實質(zhì)內(nèi)延伸，相互聯(lián)接形成假小葉；實驗組大鼠肝臟內(nèi)部纖維化水平減輕顯著，雖然仍有假小葉，但是小葉四周與內(nèi)部的膠原纖維量顯著降低，肝小葉形態(tài)基本正常，肝細胞外基質(zhì)（ECM）排列與正常相似；對照組介于兩者之間。
　　免疫組化檢測結(jié)果：正常組肝組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原主要分布在匯管區(qū)，呈褐色，陽性染

20、色區(qū)域少；移植4周后對照組Ⅰ、Ⅲ膠原染色顯示褐色區(qū)域穿插在脂肪變性細胞間，樹枝狀分布，染色區(qū)域明顯增多；TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅰ、Ⅲ膠原染色仍在脂肪變性區(qū)域，但褐色區(qū)域明顯減少；BMSCs組Ⅰ、Ⅲ膠原染色區(qū)域在對照組和實驗組間。
　　免疫組化半定量分析結(jié)果：正常組和對照組、BMSCs組、TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅰ型膠原比較F值分別為0.8899、0.6883、0.3912（P均<0.01）；對照組和B

21、MSCs組、TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅰ型膠原比較F值分別為0.2017、0.4988（P均<0.01）；BMSCs組和TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅰ型膠原比較F值為0.2971（P<0.01）。正常組和對照組、BMSCs組、TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅲ型膠原比較F值分別為0.79853、0.5978、0.3993（P均<0.01）；對照組和BMSCs組、TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅲ型膠原比

22、較F值分別為0.1874、0.3859（P均<0.01）；BMSCs組和TIMP-1-shRNA-BMSCs組Ⅲ型膠原比較F值為0.1985（P<0.01）。經(jīng)移植治療后，TIMP-1-shRNA-BMSCs組膠原含量明顯減少，纖維化程度減輕。
　　血清學檢測結(jié)果：全自動生化分析儀檢測各組大鼠肝功能指標顯示：TIMP-1-shRNA-BMSCs組、BMSCs組和對照組ALT、AST水平均顯著高于正常對照組（P＜0.01)，TIMP

23、-1-shRNA-BMSCs組和BMSCs組ALT、AST水平低于對照組（P＜0.05)，TIMP-1-shRNA-BMSCs組ALT下降明顯（（P＜0.01)）。
　　【結(jié)論】
　　1、通過MSCs貼壁性質(zhì)，在體外環(huán)境下成功分離、培養(yǎng)和擴增了大鼠骨髓MSCs，鑒定符合BMSCS的生物學特性，為進一步行干細胞研究奠定基礎。
　　2、設計并成功地合成了3組沉默大鼠TIMP-1基因的短發(fā)夾RNA，通過慢病毒包裝系統(tǒng)成功構(gòu)建