缺血預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌損傷修復(fù)的影響及修復(fù)細(xì)胞來源的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　缺血預(yù)處理(Ischemic Preconditioning, IPC)是一種對(duì)缺血再灌注心肌的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，主要通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減少心肌梗死面積。但I(xiàn)PC是否能夠通過刺激細(xì)胞增殖，補(bǔ)充心肌細(xì)胞數(shù)量來修復(fù)受損心肌組織尚不明確。本研究通過建立大鼠缺血預(yù)處理模型，對(duì)細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67進(jìn)行檢測(cè)，觀察心肌細(xì)胞的增殖；通過檢測(cè)特異心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4以及干細(xì)胞標(biāo)記物c-Kit的表達(dá)水平，探究增殖細(xì)胞的

2、來源。
　　方法：
　　1．動(dòng)物模型建立。雄性健康Vista大鼠，8周齡(220±25g)，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、缺血預(yù)處理組(IPC)。于術(shù)后1天、3天、7天、14天處死大鼠并取材，分別對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2．心肌組織的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。HE染色法觀察比較Sham、I/R和IPC組心肌組織的損傷程度。
　　3．細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67的檢測(cè)。采用免疫熒光雙標(biāo)染色法和免疫組織化學(xué)

3、SABC法檢測(cè)Ki67在處理組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，并鏡下隨機(jī)選取十個(gè)視野對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　4．心肌組織中新生心肌細(xì)胞來源的指標(biāo)分別用RT-PCR、western blot、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。
　　(1)采用RT-PCR檢測(cè)特異心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4以及干細(xì)胞特異標(biāo)記物c-Kit的表達(dá)；
　　(2)運(yùn)用western blot檢測(cè)GATA4以及干細(xì)胞特異標(biāo)記物c-Kit的表達(dá)；
　　(

4、3)組織水平利用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)GATA4、Nkx2.5的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)GATA4、Nkx2.5、c-Kit的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1．模型的建立。缺血成功判定：結(jié)扎過程ST段抬高；恢復(fù)血液的再灌，ST段恢復(fù)至正常。
　　2．肌組織HE染色。對(duì)各組心肌組織行HE染色，于鏡下進(jìn)行觀察，Sham組心肌病理改變不明顯，肌纖維走行自然，排列整齊；I/R組心肌細(xì)胞明顯膨大，部分細(xì)

5、胞胞膜及細(xì)胞核發(fā)生溶解，排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著，而IPC組病理改變明顯減輕，肌纖維的排列相對(duì)整齊，細(xì)胞的腫脹減輕較明顯，炎性細(xì)胞在組織內(nèi)浸潤(rùn)減少。
　　3．心肌細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67檢測(cè)結(jié)果。
　　(1)免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)Ki67：Sham組的陽性細(xì)胞非常少，I/R組和IPC組的陽性細(xì)胞數(shù)在術(shù)后增多，但程度不同。與Sham組比較，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IPC組陽性細(xì)胞顯著增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與I/R組比較，I

6、PC組Ki67陽性細(xì)胞數(shù)在術(shù)后第三天和第七天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(2)Ki67免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果：IPC組與Sham組比較，在術(shù)后第一天，第三天和第七天陽性細(xì)胞數(shù)差異顯著(P<0.05)；術(shù)后第三天、第七天IPC組和I/R組比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4．心肌組織中新生心肌細(xì)胞來源的檢測(cè)結(jié)果
　　(1)mRNA水平檢測(cè)c-Kit、Nkx2.5、GATA4的表達(dá)結(jié)果：

7、　　經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，IPC組和I/R組，c-Kit、Nkx2.5和GATA-4的表達(dá)趨勢(shì)相近，確定IPC組c-Kit表達(dá)量峰值在第三天， I/R組出現(xiàn)在第七天，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(2)蛋白水平檢測(cè)c-Kit、GATA4的表達(dá)結(jié)果
　　Sham組c-Kit、GATA4有微量的表達(dá)。IPC和I/R組表達(dá)量均有顯著增加。IPC與I/R組比較，二者表達(dá)水平于第一天，第三天和第七天比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

8、5)。
　　(3)組織水平檢測(cè)Nkx2.5、GATA4的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)Nkx2.5、GATA4表達(dá)：對(duì)照組Nkx2.5、GATA4幾乎沒有陽性結(jié)果，IPC組和I/R組陽性單位增加，其在術(shù)后顯著大于Sham組，IPC組在第一天，第三天和第七天與I/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)c-Kit、Nkx2.5、GATA4（c-Kit分別與Nkx2.5、GATA4組合）：處理

9、后各時(shí)間點(diǎn)Sham組兩指標(biāo)陽性單位均顯著少于IPC組和I/R組(P<0.05)。組間比較，術(shù)后第一天，第三天和第七天陽性細(xì)胞數(shù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IPC組的陽性細(xì)胞數(shù)在第三天達(dá)到峰值(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．IPC可有效減少心肌梗死面積，減輕心肌梗死病理學(xué)改變。
　　2．IPC可以增加細(xì)胞增殖特異性指標(biāo)Ki67的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞再生。
　　3．IPC及I/R使得Nkx2.5、GATA4、c-Ki