冰島硫化葉菌Sulfolobus islandicus新型ATPase的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、古菌是與細(xì)菌和真核生物并列的第三域生命形式，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝方式與細(xì)菌類似但遺傳信息加工傳遞機(jī)制，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)和蛋白翻譯，更接近于真核生物。硫化葉菌是典型的超嗜熱泉古菌，生活于高溫及酸性極端環(huán)境，但其基因組保持穩(wěn)定，自發(fā)突變率并不高，暗示其細(xì)胞內(nèi)有一套完善的DNA修復(fù)系統(tǒng)。根據(jù)已有的報道，在硫化葉菌細(xì)胞中存在的DNA修復(fù)途徑包括同源重組修復(fù)，核酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)。與細(xì)菌相比，參與這些修復(fù)途徑的蛋白也更接近于真核

2、生物。
　　DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)是細(xì)胞內(nèi)最嚴(yán)重的DNA損傷形式之一。同源重組修復(fù)和非同源末端鏈接是修復(fù)DSBs的兩種重要途徑。目前，在絕大多數(shù)古菌中只發(fā)現(xiàn)了同源重組修復(fù)途徑，對參與該途徑的保守蛋白Mre11，Rad50和重組酶RadA(真核生物中為Rad51)都有深入的研究。除此之外，對古菌中參與同源重組修復(fù)的其他蛋白也有較多的報道，包括NurA，HerA，Hjc和Hje等。Holl

3、iday junction(HJ)是同源重組過程中的標(biāo)志性中間產(chǎn)物，HJ需要被及時的處理以保證順利地完成DNA修復(fù)和和色體的正常分離。細(xì)胞內(nèi)處理HJ的方式主要有兩種，一種是由HJ解離酶介導(dǎo)的“resolution”，典型的HJ解離酶包括RuvC，Hjc，Yen1/GEN1和Slx1-Slx4/SLX1-SLX4;另一種是由解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶及其他蛋白組成的復(fù)合體介導(dǎo)的“ dissolution”。在細(xì)菌中已經(jīng)報道參與“ resoluti

4、on”過程的蛋白是RuvAB復(fù)合物。到目前為止，在古菌和真核生物中還沒有鑒有到經(jīng)典的類似于RuvAB的蛋白復(fù)合物。
　　在本研究中，我們在超嗜熱古菌冰島硫化葉菌S.islandicus細(xì)胞中表達(dá)了羧基端帶有組有組酸標(biāo)簽的解離酶Hjc(基因組中其編碼基因為SiRe_1431)，通過親和純化和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了與Hjc在基因基上位置相鄰并可能與Hjc存在相互作用的一個蛋白，SiRe_1432。對氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)， SiRe_1432包含

5、典型的PIN結(jié)構(gòu)域和P-loopATPase結(jié)構(gòu)域，因此將SiRe_1432命名為SisPINA(冰島硫化葉菌來源的PIN domain-containing P-loop ATPase)。進(jìn)一步，我們通過Pull-down實驗確認(rèn)了SisPINA與Hjc具有物理相互作用，暗示著SisPINA與Hjc可能在細(xì)胞內(nèi)共同參與HJ的處理。
　　為了探索SisPINA在冰島硫化葉菌S.islandicus中的功能，我們嘗試敲除細(xì)胞內(nèi)染色體

6、上SisPINA的編碼基因，嘗試多次后始終無法獲得敲除SisPINA基因的缺失突變體菌株，暗示著SisPINA可能是一個不可敲除的基因。利用遺傳回補(bǔ)實驗我們確認(rèn)了SisPINA是S.islandicus細(xì)胞正常生長所必須的基因。
　　接下來，我們鑒定了SisPINA的基本生化性質(zhì)。首先，構(gòu)建了表達(dá)野生型和四個不同點(diǎn)突變體的載體;然后，在E.coii中進(jìn)行異源表達(dá)后并對目的蛋白進(jìn)行了純化。最后，我們鑒定了SisPINA的ATP水解活

7、性、DNA結(jié)合活性和HJ鏈遷移活性。ATP水解實驗表明SisPINA具有明顯的ATP水解能力，不同的DNA底物對其ATPase活性無明顯的影響。凝膠阻滯實驗表明SisPINA能夠結(jié)合不同類型的DNA底物，包括單鏈DNA、鈍端雙鏈DNA、5’-overhang DNA、 Y形DNA、復(fù)制叉DNA和HJ DNA，但是結(jié)合復(fù)制叉DNA和HJ DNA的能力明顯強(qiáng)于其他DNA底物。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)SisPINA能催化HJ DNA發(fā)生鏈遷移，生成Y

8、形的遷移產(chǎn)物，并能夠繼續(xù)解鏈Y形DNA產(chǎn)生單鏈DNA。同時，我們確認(rèn)了SisPINA的鏈遷移活性依賴其ATPase活性。
　　為了進(jìn)一步研究SisPINA在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，我們鑒定了與SisPINA相互作用的蛋白并分析了蛋白之間的相互作用。實驗結(jié)果表明， SisPINA與 Hjc具有功能上的相互作用，SisPINA能夠明顯增強(qiáng)Hjc切割不可動HJDNA的解離酶活性，同時，Njc切割可動HJ DNA的鏈的偏好性也受到SisPIN

9、A的調(diào)節(jié)，但Hjc對SisPINA的HJ鏈遷移活性則有明顯的抑制作用。除了與Hjc有相互作用，SisPINA和RFCs及Hjm都能分別形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Pull-down實驗進(jìn)一步確認(rèn)了SisPINA的羧基端區(qū)域介導(dǎo)了SisPINA與Nc，RFCs和Hjm的相互作用。
　　最后，為了從原子水平上揭示SisPINA的作用機(jī)理，我們解析了SisPINA兩個突變體的晶體結(jié)構(gòu)。SisPINAK261A的晶體結(jié)構(gòu)顯示，一個SisPINA的晶

10、胞中包含有6個SisPINA蛋白分子，SisPINA可形成穩(wěn)定的環(huán)形六聚體，該結(jié)果與SisPINA在溶液中也形成六聚體的結(jié)果一致。進(jìn)一步分析組成SisPINA六聚體的亞基，我們發(fā)現(xiàn)六個亞基處于兩種不同的構(gòu)象，其中亞基A(B，C和E)為未結(jié)合AT結(jié)的構(gòu)象，亞基D（F)為結(jié)合ATP的構(gòu)象。通過ATP的結(jié)合和水解引起SisPINA構(gòu)象的變化，從而推動HJ發(fā)生鏈遷移。 SisPINAR147KI199SR206A的晶體結(jié)構(gòu)顯示，SisPINA的

11、羧基端可折疊形成一個KH結(jié)構(gòu)域(hnRNPKhomology結(jié)構(gòu)域)，在SisPINAK261A的晶體結(jié)構(gòu)中由于電子密度缺失并未觀察到該區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)。有意思的是在該突變體的晶胞中只包含有一個SisPINAR147KI199SR206A蛋白分子，這種突變導(dǎo)致SisPINA發(fā)生解聚的分子機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。根據(jù)SisPINA和Hjc的晶體結(jié)構(gòu)，以及SisPINA與Hjc功能上的相互作用，我們構(gòu)建了SisPINA和Hjc共同處理HJDN