Angiogenin對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響及相關(guān)miRNA機(jī)制研究.pdf

1、滋養(yǎng)細(xì)胞（TB）是構(gòu)成哺乳動(dòng)物胎盤(pán)組織的重要功能細(xì)胞，在正常早期妊娠過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)“節(jié)制性”的“生理侵襲”能力到達(dá)子宮肌層約1/3處的母體蛻膜組織，促使螺旋動(dòng)脈重鑄、擴(kuò)張，進(jìn)而滿足正常生理妊娠過(guò)程中母胎間的營(yíng)養(yǎng)供給和血液供應(yīng)。正常生理狀態(tài)下，滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性侵襲”具有明顯的時(shí)間性和空間性，即滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能僅發(fā)生在妊娠早期階段，在妊娠12周時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸減弱在妊娠14-20周時(shí)基本結(jié)束；同時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞僅侵襲到子宮肌層1

2、/3處，而對(duì)深層組織無(wú)影響。病理狀態(tài)下，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能異常將直接導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生，如滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度侵襲，破壞周圍組織會(huì)導(dǎo)致絨毛膜癌等腫瘤疾病的發(fā)生；而在子癇前期（PE）發(fā)病過(guò)程中，由于多種因素共同作用導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞植入深度不足，進(jìn)而使螺旋動(dòng)脈的植入和重鑄受到限制，最終導(dǎo)致流產(chǎn)、胎盤(pán)缺血、發(fā)育受限等。由此可見(jiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性的侵襲功能”是受精卵的成功植入和胚胎發(fā)育的重要前提，但目前關(guān)于其侵襲功能的具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。

3、r>　　本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，5％蛻膜基質(zhì)條件培養(yǎng)液（DSCM）處理后的HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)MMP-2表達(dá)水平和酶活性顯著增強(qiáng)；而20%DSCM處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯減弱，MMP-2表達(dá)及酶活性顯著降低。隨后我們通過(guò)蛋白芯片比對(duì)不同處理組中差異表達(dá)的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn)，5%DSCM處理后的HTR8/SVneo細(xì)胞中angiogenin表達(dá)明顯增加，而20%DSCM處理后angi

4、ogenin表達(dá)顯著減低，angiogenin表達(dá)水平與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力密切相關(guān)，因此推測(cè) angiogenin可能對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　目的及方法:針對(duì)上述問(wèn)題，在前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)qPCR和Western blot方法明確Angiogenin在不同滋養(yǎng)細(xì)胞系和臨床樣本中的表達(dá)；在構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的基礎(chǔ)上，使用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Angiogenin對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功

5、能的調(diào)控作用；通過(guò)qPCR、Western blot、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和功能挽救實(shí)驗(yàn)等方法闡明參與Angiogenin調(diào)控的可能 miRNA機(jī)制；通過(guò)對(duì)正?；颊吆蚉E患者臨床樣本中Angiogenin等相關(guān)因子的相關(guān)性分析進(jìn)一步論證Angiogenin及其相關(guān)miRNA機(jī)制在PE發(fā)病中的作用。
　　結(jié)果:
　　本課題研究結(jié)果可以分為以下4個(gè)部分，具體如下：
　　1. Angiogenin在不同DSCM處理組細(xì)胞和臨床樣本中

6、的表達(dá)分析：首先我們對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與芯片結(jié)果一致，使用不同DSCM處理后滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力與細(xì)胞中Angiogenin的表達(dá)明顯相關(guān)，具有較強(qiáng)侵襲能力的絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3中Angiogenin表達(dá)明顯高于正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo，子癇前期患者胎盤(pán)組織中Angiogenin表達(dá)顯著低于正常妊娠患者。本部分研究結(jié)果提示Angiogenin可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能調(diào)控。
　　2. An

7、giogenin對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響：為了證實(shí)Angiogenin對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，首先設(shè)計(jì)并構(gòu)建了Angiogenin的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCMV-ANG，通過(guò)質(zhì)粒測(cè)序和Western blot結(jié)果證實(shí)其構(gòu)建成功；使用pCMV-ANG過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，同時(shí)細(xì)胞中 MMP-2的表達(dá)顯著增加；使用 Angiogenin的si

8、RNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo發(fā)現(xiàn)，通過(guò)siRNA降低Angiogenin表達(dá)后可以顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，同時(shí) MMP-2表達(dá)減低；為了證實(shí) Angiogenin調(diào)控與MMP-2的相關(guān)性，使用MMP-2的siRNA設(shè)計(jì)了功能挽救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低MMP-2表達(dá)后可以明顯抑制Angiogenin對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的促進(jìn)作用。本部分研究結(jié)果提示，Angiogenin可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能，其調(diào)控作用依賴于MMP

9、-2的表達(dá)。
　　3. Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的 miRNA機(jī)制研究：為了進(jìn)一步研究Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞機(jī)制，對(duì)以往文獻(xiàn)中miRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和qPCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞中差異表達(dá)的miR-519d-3p可能參與了其調(diào)控；使用miR-519d-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后的Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p可以明顯抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能

10、力；使用 miR-519d-3p mimics和MMP-2 siRNA等進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、qPCR、Western blot實(shí)驗(yàn)和功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，MMP-23’UTR區(qū)域存在一個(gè) miR-519d-3p的結(jié)合位點(diǎn)，miR-519d-3p可以抑制MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)，miR-519d-3p通過(guò)抑制其靶基因 MMP-2表達(dá)進(jìn)而調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能；為了明確 Angiogenin與miR-519d-3p的相互調(diào)

11、控關(guān)系及其在調(diào)控功能中的作用，對(duì)不同Angiogenin處理組中miR-519d-3p表達(dá)譜進(jìn)行分析，并使用Angiogenin siRNA和miR-519d-3p inhibitor進(jìn)行功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Angiogenin可以抑制miR-519d-3p表達(dá)，其可以通過(guò)調(diào)控下游miR-519d-3p/MMP-2信號(hào)通路進(jìn)而參與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能調(diào)控。
　　4. Angiogenin、miR-519d-5p和MMP-

12、2在PE臨床樣本中的表達(dá)分析：為了證實(shí)Angiogenin/miR-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路在臨床滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病如PE發(fā)病中的作用，我們針對(duì)正?；颊吆蛃PE患者胎盤(pán)組織中Angiogenin、miR-519d-3p和MMP-2表達(dá)進(jìn)行了qPCR檢測(cè)和Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析。qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常患者相比，sPE患者胎盤(pán)中Angiogenin和MMP-2表達(dá)明顯降低，而miR-519d-3p表達(dá)顯著升高；Pea

13、rson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析證實(shí)，sPE患者胎盤(pán)組織中Angiogenin、miR-519d-3p和MMP-2表達(dá)明顯相關(guān)，提示Angiogenin/ miR-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路可能參與了臨床PE的發(fā)病過(guò)程。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)以上本課題研究結(jié)果，最終有以下幾點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：
　　1. Angiogenin參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的調(diào)控，它可以明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能，其作用依賴于調(diào)控下游MMP