木犀草素與葉酸對黃曲霉毒素B1毒性的保護作用及木犀草素抗癌作用研究.pdf

1、目的：
　　(1)用木犀草素(Luteolin，Lut)及葉酸(Folic acid,FA)干預經黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)染毒的人正常食管上皮細胞，觀察其對細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因、葉酸受體1(folate receptor1/a，F(xiàn)OLR1/FRa)基因表達及MTHFR基因啟動子區(qū)甲基

2、化狀態(tài)的影響，探索Lut及FA干預對AFB1毒性的保護作用及其機制，為Lut的臨床應用及其與FA對預防、控制AFB1對人正常食管上皮細胞的毒性作用提供一定的實驗基礎和理論依據(jù)。(2)Lut干預食管癌Eca109細胞，探討Lut誘導人食管癌Eca109細胞凋亡的作用及其作用機制。
　　方法：
　　(1)AFB1染毒處理對人正常食管上皮細胞生理學的影響:用Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)測定AFB1對人

3、食管正常上皮細胞增殖的影響;流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測細胞周期變化及細胞凋亡情況。(2)Lut及FA對AFB1染毒處理的人正常食管上皮細胞的干預作用的研究:用Lut及FA干預AFB1處理的人類正常食管上皮細胞，CCK8法檢測細胞生長狀況，F(xiàn)CM檢測細胞周期變化及細胞凋亡情況。(3)Lut及FA對經AFB1染毒的人正常食管上皮細胞MTHFR、FOLR1基因影響的研究:Real-time PCR檢測MTHFR、F

4、OLR1mRNA的表達情況;Western blot檢測MTHFR、FOLR1蛋白表達情況;MassArray甲基化定量檢測細胞MTHFR基因啟動子區(qū)甲基化水平。(4)Lut對人食管癌Eca109細胞生理學的影響及其作用機制的研究:四甲基氮唑藍(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法檢測Lut對Eca109細胞增殖的影響;FCM檢測食管癌細胞周期和凋亡情況;Real-time PCR檢測食管癌Eca109細

5、胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA的表達情況;Western Blot檢測食管癌Eca109細胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.AFB1染毒處理對人正常食管上皮細胞生理學的影響:(1)用13μM、25μM、50μM、100μM、200μM AFB1處理人類正常食管上皮細胞24h、48h、72h，均可以抑制細胞增殖;(2)FCM

6、周期檢測結果顯示，AFB1主要作用于人正常食管細胞的G0/G1期及S期，50μM、100μM、200μM AFB1處理細胞24h，G0/G1期細胞比例明顯升高(p＜0.05)，S期細胞比例明顯降低(p＜0.05)，細胞被阻滯在G0/G1期;(3)100μM、200μM AFB1組細胞凋亡比例明顯高于空白對照組(p＜0.05)，50μMAFB1組早期凋亡細胞比例明顯升高(p＜0.05)。
　　2.Lut及FA對經AFB1染毒的人正常

7、食管上皮細胞的干預作用的研究:(1)Lut及Lut聯(lián)用FA干預組細胞抑制率明顯低于染毒對照組(p＜0.05)，F(xiàn)A單獨干預的效果不明顯(P＞0.05);(2)Lut、Lut聯(lián)合FA干預組G0/G1期細胞比例較染毒組明顯降低(P＜0.05)，S期的細胞所占比例明顯高于染毒對照組(P＜0.05);FA干預效果不明顯;(3)Lut、Lut聯(lián)合FA干預組細胞凋亡率明顯低于染毒對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.Lut及F

8、A對經AFB1染毒的人正常食管上皮細胞MTHFR、FOLR1基因影響的研究:(1)Real-time PCR檢測結果顯示:AFB1染毒24h上調人正常食管上皮細胞MTHFR、FOLR1mRNA的表達(P＜0.05)。經Lut干預后，細胞MTHFR、FOLR1mRNA的表達明顯減少(P＞0.05)。用20μM、200μM FA進行干預，細胞MTHFR mRNA的表達未受明顯的影響(P＞0.05);而200μM FA組FOLR1mRNA的表

9、達明顯下降(P＜0.05)，20μM FA組下調效果不及200μMFA組(P＜0.05）。Lut聯(lián)用FA干預能明顯減弱AFB1對MTHFR mRNA表達的上調影響(P＜0.05)，Lut聯(lián)用20μMFA組與Lut聯(lián)用200μM FA組對經AFB1染毒的人正常食管上皮細胞FOLR1mRNA表達產生不同的調節(jié)作用(P＜0.05);(2)實驗結果顯示，AFB1染毒上調人正常食管上皮細胞MTHFR蛋白的表達(P＜0.05），下調FOLR1蛋白的

10、表達(P＜0.05）。經Lut干預后，細胞MTHFR蛋白表達減少、FOLR1蛋白表達增加(P＜0.05)。20μM、200μM FA干預組細胞MTHFR蛋白的表達程度與染毒組相近(P＞0.05);FOLR1蛋白表達程度接近空白對照組(P＞0.05)，提示FA對MTHFR蛋白表達干預效果不明顯，對FOLR1蛋白表達的干預效果明顯。Lut聯(lián)用FA干預能明顯減弱AFB1對MTHFR、FOLR1蛋白表達的影響(P＜0.05)。(3)MassAr

11、ray甲基化定量檢測細胞MTHFR擴增子中的CpG單位的甲基化水平，結果顯示，CpG_5、CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42單位的染毒組甲基化水平明顯高于空白對照組(P＜0.05)。比較Cpg_5和CpG_35位點的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)Lut組及Lut聯(lián)用200μMFA干預組的甲基化水平明顯低于染毒組(P＜0.05），與空白對照組接近(P＞0.05);CpG_6.7位點，染毒組細胞甲基化水平明顯高于空白對照組(P＜0.

12、05)，200μM FA組的甲基化水平明顯低于染毒組(P＜0.05);CpG_16、CpG_42位點，除20μM FA干預組，其余各干預組干預效果明顯(P＜0.05）。
　　4.Lut對人食管癌Eca109細胞生理學的影響及其作用機制的研究:(1)MTT實驗結果表明，用Lut濃度為40μM、80μM、120μM、160μM、200μM、240μM處理食管癌Eca109細胞24h、48h和72h，均可以抑制細胞增殖(P＜0.05)，

13、且隨Lut濃度的增加，呈倒U型;(2)選用40μM、160μM、240μM為后期實驗干預濃度，經FCM檢測，Lut濃度為160μM、240μM時，細胞阻滯于S期間，并在濃度為160μM時誘導細胞凋亡，細胞早凋率明顯增加(P＜0.05);(3)Lut可下調CDK2mRNA的表達(P＜0.05），且隨著濃度的增加，Lut對CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA表達的作用呈現(xiàn)出先促進后抑制的趨勢;(4)Lut可下調CDK2

14、蛋白表達(P＜0.05)，對CyclinA表達的作用表現(xiàn)為先促進后抑制，160μM、240μM Lut組CyclinA蛋白表達受抑制(P＜0.05），蛋白表達水平隨劑量的增加而降低。Lut對Caspase9、Caspase3表達呈現(xiàn)先增加后抑制的作用趨勢，240μM Lut組Caspase9、Caspase3蛋白表達明顯受抑制（P＜0.05）。
　　結論:
　　(1)AFB1能夠通過阻滯細胞周期，促進細胞凋亡，來抑制人正常食

15、管上皮細胞增殖，并存在一定的劑量-效應關系，Lut和FA的干預能夠減弱AFB1對人正常食管上皮細胞的增殖抑制、周期阻滯及凋亡促進作用，對AFB1的毒性作用起到一定的保護作用。(2)Lut和FA的干預可以減弱AFB1對人正常食管上皮細胞MTHFR、FOLR1mRNA和蛋白表達的影響，改善細胞FA代謝，從而發(fā)揮對人正常食管上皮細胞的保護作用;Lut及FA可以減弱AFB1對人正常食管上皮細胞的毒性作用，保護人正常食管上皮細胞。Lut及FA的干