流感H5N1-H9N2型二價(jià)病毒樣顆粒疫苗的研制.pdf

1、近年來，由禽流感病毒引起的流感疫情在全球各地大規(guī)模爆發(fā)。高致病性禽流感不僅能使禽類大批量死亡，而且還能感染人類引發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病。低致病性禽流感會(huì)引起家禽患病、產(chǎn)蛋量下降甚至死亡。因此爆發(fā)禽流感疫情將導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅人類生命健康。隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，H9N2型禽流感爆發(fā)將帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。H5N1型禽流感病毒致病能力強(qiáng)，能使人類和家禽均患病且死亡率高，已然成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，我國防

2、治禽流感疫情主要依靠疫苗免疫接種。市場上銷售的禽流感疫苗主要以滅活疫苗為主，但該疫苗存在返毒風(fēng)險(xiǎn)及滅活劑等缺點(diǎn)，無法應(yīng)對(duì)禽流感疫情的爆發(fā)。因此研制出高效安全的流感疫苗越來越受到關(guān)注。由于VLP不含有病毒核酸，無致病性，且其表面具有抗原成分，是新型疫苗研究的熱點(diǎn)。目前，我國尚未出現(xiàn)用于預(yù)防H5N1、H9N2型禽流感的VLP疫苗?；谝陨蠁栴}，本課題將研制出三種不同佐劑類型的流感H5N1/H9N2型二價(jià)VLP疫苗，并從免疫方面驗(yàn)證二價(jià)VLP

3、疫苗的免疫效果。
　　目的：本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備H5N1 VLP和H9N2 VLP，以脂質(zhì)體、白油及殼聚糖微球?yàn)樽魟?，研制出三種不同佐劑的二價(jià)VLP疫苗。對(duì)VLP疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫效果評(píng)價(jià)，篩選出免疫原性強(qiáng)、安全及長效的流感H5N1/H9N2型二價(jià)VLP疫苗。
　　方法：通過對(duì)H5N1和H9N2重組桿狀病毒P1代進(jìn)行增殖及TCID50測定，Western Blot檢測VLP中HA、M1蛋白的特異性，并用ELISA和血

4、球凝集實(shí)驗(yàn)分別測定VLP中HA含量及其血凝效價(jià)。其次采用薄膜凍融法制備脂質(zhì)體，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)篩選出脂質(zhì)體制備的最佳工藝，研制出二價(jià)脂質(zhì)體VLP疫苗，并對(duì)脂質(zhì)體的包封率、物理穩(wěn)定性、剩余水分和安全性等檢驗(yàn)。擬用白油及微球佐劑制備出二價(jià)VLP油乳佐劑疫苗、二價(jià)微球VLP疫苗，并對(duì)二價(jià)VLP疫苗進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量安全評(píng)價(jià)及安全試驗(yàn)。最后通過動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)檢測二價(jià)VLP疫苗特異性抗體水平。
　　結(jié)果：
　　1.通過Western Bl

5、ot鑒定、HA定量ELISA及血球凝集實(shí)驗(yàn)檢測兩種VLP。結(jié)果表明，H5N1和H9N2 VLP均出現(xiàn)特異性條帶，HA含量分別為134.42±4.78μg/mL、129.73±4.20μg/mL。具有較高的免疫原性，可作為二價(jià)VLP疫苗的原料。
　　2.制備的二價(jià)VLP疫苗脂質(zhì)體的包封率為83.37％，真空烘干法測得的脂質(zhì)體凍干粉剩余水分為2.5%，4℃低溫保存120天后其包封率達(dá)60.78%。油乳佐劑疫苗的穩(wěn)定性常數(shù)為95.5%，

6、二價(jià)微球VLP疫苗的體外釋放度達(dá)83.1%。
　　3.免疫SPF雞28d后，脂質(zhì)體組抗H5N1抗體及抗H9N2抗體的HI滴度分別為9.28Log2、9.43Log2，均顯著高于油乳和微球?qū)嶒?yàn)組的抗體滴度（p＜0.01）；除脂質(zhì)體組外，其它各實(shí)驗(yàn)組中和H5N1、H9N2病毒的抗體滴度均顯著低于滅活疫苗組（p＜0.01），而脂質(zhì)體組中和H5N1、H9N2病毒的中和價(jià)分別為1/97、1/103，顯著高于油乳及微球?qū)嶒?yàn)組（p＜0.01）；

7、T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫28d后脂質(zhì)體組的SI指數(shù)與滅活疫苗組無顯著差異，且顯著高于微球及油乳實(shí)驗(yàn)組（p＜0.01），免疫56d后脂質(zhì)體組的SI指數(shù)均高于微球及油乳實(shí)驗(yàn)組（p＜0.01），H5N1病毒、H9N2病毒刺激脂質(zhì)體組 T淋巴細(xì)胞增殖的SI指數(shù)分別為4.29、5.65，能引起有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論：本課題初步研制的二價(jià)脂質(zhì)體VLP疫苗，免疫動(dòng)物后能誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，能為VLP疫苗的研制提供一