計算機輔助分子設計提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、酶作為天然的生物催化劑,具有高催化效率和高底物選擇特異性的特點,在工業(yè)生產(chǎn)上擁有巨大的應用潛力和良好的發(fā)展前景。但是許多酶分子對工業(yè)生產(chǎn)中熱處理的耐受性較差,嚴重制約了它們在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。因此研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定機制與通過理性設計提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一直是計算生物學及蛋白質(zhì)工程領域中的一個研究熱點。這對擴大酶的應用范圍與探究蛋白質(zhì)結構和功能的關系均具有重要意義。
　　 本研究中我們設計了兩個策略分別從微觀與宏觀兩方面分析確定了

2、影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關鍵氨基酸,并以來源于Ochrobactrum sp.M231的甲基對硫磷水解酶(MPH-Ochr)為研究對象,利用實驗來驗證設計策略的有效性。
　　 策略一為創(chuàng)新性的將分子動力學模擬應用到蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究中。其計算步驟主要包括首先利用分子動力學模擬來尋找蛋白質(zhì)活性中心以外的構象不穩(wěn)定區(qū)段,查找構象不穩(wěn)定區(qū)段內(nèi)部或其附近的柔性氨基酸(如甘氨酸),并將這些柔性氨基酸突變?yōu)閯傂园被?如脯氨酸),再利用分子動

3、力學模擬來驗證這些突變對構象不穩(wěn)定區(qū)段的影響,即對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響。將該策略應用到MPH—Ochr,首先通過分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)在該酶的第186-193位氨基酸的構象非常不穩(wěn)定,并且這些氨基酸不在蛋白質(zhì)的活性中心,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)段的下游存在兩個甘氨酸(G194及G198),通過同源模建模擬了三個突變體(G194P,G194P／G198P及G198P)的三維結構,再利用分子動力學模擬來驗證這些突變的效果,發(fā)現(xiàn)只有突變G194P能明

4、顯提高區(qū)段186—193的構象穩(wěn)定性。將野生型與三個突變體的基因進行表達、蛋白質(zhì)純化并測定各自的熱穩(wěn)定性,實驗結果與計算結果基本一致,G194P的Tm值與750分別比野生型提高了3.3℃與4.6℃。熱動力學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)G194P的焓變和野生型相當,但其熵變比野生型更低,這表明其受熱處理時構象更加穩(wěn)定。這些實驗結果表明該策略是有效的針對蛋白質(zhì)進行熱穩(wěn)定性改造的分子設計方法。
　　 策略二為通過計算突變體和野生型蛋白質(zhì)解折疊自由能的

5、差值(△△G)和其正負類別來篩選可能會影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的位點。在本研究中我們設計了新的一個基于蛋白質(zhì)結構的預測突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性影響的具體數(shù)值(即:△△G值)和其正負類別的軟件Prethermut。該軟件有兩個主要的特征,其一為它可以預測單點與多點突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響；其二為首次在特征設計的過程中引入了一個蛋白質(zhì)標準特征,將突變體的結構特征和這個蛋白質(zhì)標準特征進行比較,而不是直接將突變體的結構特征和野生型蛋白質(zhì)的結構特征進行比

6、較。用數(shù)據(jù)集S-dataset來測試該軟件的性能,并將其與一些常用的類似軟件進行比較,結果表明該軟件無論是分類預測的能力還是回歸預測的能力均優(yōu)于已有的常用軟件。
　　 我們同樣將該策略應用于MPH-Ochr來提高該酶的熱穩(wěn)定性并檢驗該策略的有效性。利用蛋白質(zhì)的位點進化熵(E),Prethermut的分類預測結果以及回歸預測結果,篩選到可能不影響該酶的功能但可能會改善其熱穩(wěn)定性的7個氨基酸位點。在這7個位點構建定點飽和突變體庫,從

7、中篩選出陽性克隆,再評估突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響,結果表明有6個突變體庫均可以篩選得到熱穩(wěn)定性較野生酶提高的突變體。這些實驗結果表明利用該策略篩選影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性位點的方法是行之有效的。
　　 根據(jù)篩選到的6個突變體庫中的單點突變信息,進行多點組合突變。組合突變的策略為先將篩選突變體文庫獲得的6個突變體按照熱穩(wěn)定性提高程度進行排序,然后在最優(yōu)的單點突變體的基礎上進行雙點突變(突變位點為熱穩(wěn)定性第二優(yōu)的突變位點),然后在最優(yōu)的