干酪乳桿菌遺傳操作系統(tǒng)的構建與應用.pdf

1、乳酸桿菌攜帶不同的質(zhì)粒，尤以θ復制質(zhì)粒最為常見。本課題從酸奶發(fā)酵劑中分離得到一系列的乳酸菌，對這些乳酸菌株進行質(zhì)粒分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)乳桿菌株含有質(zhì)粒。其中一株乳酸菌菌株含有兩個不同大小的質(zhì)粒。通過對該菌株的16SrRNA測序分析，并結(jié)合常規(guī)生理生化鑒定，將菌株定名為干酪乳桿菌Lactobacillus casei MCJ(CCTCC AB20130356)。鑒于質(zhì)粒是構建穿梭載體的良好元件，我們對干酪乳桿菌MCJ的小質(zhì)粒（15kb以下）進行

2、分離，酶切，并將純化的DNA片段克隆到T載體pMD18T上進行測序，從而得到未知質(zhì)粒的序列。依據(jù)已知序列進行引物設計，通過反向PCR擴增全質(zhì)粒，進行測序。將測序結(jié)果用DNAstar7.1套件的Seqman進行拼接，得到1個完整的質(zhì)粒序列，該質(zhì)粒的大小為11274bp，G+C百分比為43.89％，攜帶9個開放閱讀框。其中包含完整的海藻糖代謝所需的操縱子基因treR，treB，treC，還包含有兩個可能的theta復制子Rep1，rep2.

3、質(zhì)粒命名為pMC11。復制子rep1由3.5個正向重復序列(Direct Repeats，DR)和假定的復制蛋白基因repA_1，repB組成?？赡艿膹椭破瘘c為oriV1。復制子rep2由4.5個正向重復序列和假定的復制蛋白基因repB_1，repA組成。通過克隆復制子oriV1和ori V2，與來自pMG36e的紅霉素基因Em、pUC18的復制子構建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pEL5.6，pEL5.7。
　　本研究通過連續(xù)的42℃

4、高溫傳代消除質(zhì)粒，得到不含pMC11質(zhì)粒的菌株L.casei MCJ△1。同時，為了找到最小的復制單位，通過對包含復制子的不同長度片段克隆，構建一系列質(zhì)粒。以L.casei MCJ△1為受體菌，轉(zhuǎn)化子結(jié)果分析表明，rep1的最小的復制單位為:由repA_1和ori V2組成，repB是非必須蛋白。而對于rep2，兩個復制蛋白基因repB-1、repA和oriV1組成最小復制單位。電轉(zhuǎn)化不同的受體菌株發(fā)現(xiàn)，pEL5.6能在干酪乳桿菌Lac

5、tobacillus casei MCJ△1、L.casei NJ、L.paracasei LPC-37、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中復制傳代，而pEL5.7僅僅能在L.casei MCJ△1、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中復制傳代。對質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，在非選擇條件下，每代質(zhì)粒丟失率低于1％，表明兩個穿梭質(zhì)粒在干酪乳桿菌中都十分穩(wěn)定。此外，pEL5.7在乳

6、酸德氏乳桿菌中穩(wěn)定性也很高，每代質(zhì)粒丟失率低于3％。通過比較不同的啟動子的活性，最終選擇嗜酸乳桿菌的S層蛋白啟動子SlpA，連同多克隆位點和終止信號tt，構建了兩個表達質(zhì)粒pELX1和pELX2。用增強的綠色熒光蛋白eGFP作為標記，檢測了外源蛋白在胞內(nèi)表達狀況。分析表明，不同菌株中GFP的表達與細胞生長時期有相關性。對數(shù)生長期熒光強度最高，細胞生長后期雖然總蛋白量增加，但熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)熒光減弱，說明SlpA啟動子在干酪乳桿菌中能正