不同生境魚類HIF-1α基因的克隆和差異性分析.pdf

1、缺氧可引起細(xì)胞產(chǎn)生一系列的代償性變化，如呼吸量增加，HIF-1感受調(diào)節(jié)性加強(qiáng)、紅細(xì)胞適應(yīng)性增多、肌紅蛋白增加等。其中低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的作用十分廣泛，現(xiàn)已知HIF-1能夠調(diào)控基因下游的60多種靶基因，是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1由活性亞基HIF-1α和組成性亞基HIF-1β組成，活性亞基HIF-1α，在低氧調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用。弄清不同生境魚類HIF-1α的序

2、列變異和進(jìn)化，對于理解分子序列變異和低氧適應(yīng)之間的相關(guān)性具有重要的意義，也可為培育和篩選耐低氧魚類品種提供理論依據(jù)。
　　本研究采用分子生物學(xué)方法，選擇不同生境代表性魚類為研究對象，對所選魚類銀鯽(Cassius auratus gibelio)、淇河鯽(Cassius auratus pengzesis)、鯰魚(Silurns asotus)、泥鰍(Paramis gurnus)，從其心臟、肝臟、腎臟、腮、肌肉中提取總RNA為模

3、板，用RT-PCR方法擴(kuò)增出cDNA序列，并進(jìn)行克隆測序。引物設(shè)計主要是基于魚類HIF-1α的保守性序列，設(shè)計和篩選一對特異性引物(上游引物加入HindⅢ酶切位點，下游引物加入XhoⅠ酶切位點)擴(kuò)增出銀鯽、淇河鯽、鯰魚、泥鰍的HIF-1α的編碼序列。將HIF-1序列經(jīng)TA連接插入到pMD19-T Simple Vector克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組的pMD19-T-HIF-1α高效克隆載體。用藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒PCR方法

4、篩選出陽性克隆，用HindⅢ和NotⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒。經(jīng)測序以及同源序列的比對，以驗證所獲得的魚類HIF-1α cDNA序列。其研究結(jié)果如下：
　　銀鯽HIF-1αcDNA序列，長度2325bp，編碼774個氨基酸。銀鯽與彭澤鯽具有最高的核酸序列一致性達(dá)到95％，其次是鯉魚(Cyprinus carpio)95％，青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)93％，白鰱(Hypophthalmichthys mo

5、litrix)91％，團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)91％，草魚(Ctenopharyngodon idellus)91％，麥穗魚(Pseudorosboraparva)90％，斑馬魚(Danio rerio)89％。通過保守結(jié)構(gòu)域分析，其具有bHLH結(jié)構(gòu)域，PAS-A結(jié)構(gòu)域，PAS-B結(jié)構(gòu)域，C-TAD保守結(jié)構(gòu)域和氧依賴降解區(qū)(Oxygen dependent degradation domain，ODD)

6、。銀鯽HIF-1α在各組織中均有分布，但其表達(dá)具有組織特異性，在心臟，鰓，腎臟中表達(dá)量較高，而在肝臟中表達(dá)量均較低。淇河鯽與銀鯽HIF-1α核酸序列相似度達(dá)97％，故二者有很高程度的類同。
　　鯰魚HIF-1α的編碼序列長2304bp，編碼767個氨基酸。鯰魚與斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的核酸序列一致性達(dá)到90％，其次是胭脂魚(Myxoeyprinus asiaticus)84％，白鰱83％，草魚83％，彭

7、澤鯽82％。通過保守區(qū)域分析，其具有bHLH結(jié)構(gòu)域，PAS-A結(jié)構(gòu)域，PAS-B結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域C-TAD。
　　泥鰍HIF-1α的編碼序列長2316bp，編碼771個氨基酸。泥鰍與鰱魚的核酸序列同源性達(dá)到85％，其次是胭脂魚85％，草魚85％，鯽魚84％。通過保守區(qū)域分析，泥鰍該序列具有PAS-A結(jié)構(gòu)域，PAS-B結(jié)構(gòu)域，bHLH結(jié)構(gòu)域以及C-TAD。
　　本研究中，為了研究不同生境魚類HIF-1α的功能特點，克隆出鯽

8、魚、鯰魚、泥鰍的HIF-1α基因序列，分析發(fā)現(xiàn)：四種魚類的HIF-1α的bHLH、PAS-A、PAS-B和C-TAD區(qū)域高度保守，ODD和N-TAD區(qū)有一定程度的變異。銀鯽和淇河鯽聚為一個系群，鯰魚和斑點叉尾鮰聚為一個系群，泥鰍獨立出來，顯然它們的進(jìn)化速度差異較大。魚類HIF-1α的進(jìn)化速度較哺乳類和兩棲類動物快，這與魚類HIF-1α的分布有一定關(guān)系。另外，將銀鯽的HIF-1α中ODD區(qū)剔除后，利用改造的HIF-1α基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒