鈍頂螺旋藻耐鹽相關基因啟動子區(qū)域的結構與功能分析.pdf

1、目的：
　　螺旋藻(Spirulina)是一類進化歷史悠久、含葉綠素a（但不形成葉綠體）、能進行產(chǎn)氧性光合作用的大型原核生物。其抗逆性強，在熱泉、鹽水湖及其他惡劣環(huán)境中，是唯一或主要的光養(yǎng)生物;螺旋藻已被廣泛應用于基礎研究，如光合作用、細胞分化與氮的固定、碳源與氮源的利用、抗環(huán)境脅迫以及分子進化等領域。本課題通過研究螺旋藻耐鹽堿基因啟動子的結構及與調(diào)控基因功能的關系，揭示螺旋藻耐鹽堿的分子機理。鑒定螺旋藻抗逆相關基因，可為植物基因

2、工程育種提供新的功能基因，也為培育抗逆性增強的螺旋藻新品種、挖掘其他藻類抗逆功能相關基因奠定基礎，具有重要的科學意義，將產(chǎn)生一定的社會效益。
　　方法：
　　1設計引物，提取螺旋藻總DNA，通過PCR方法擴增鈍頂螺旋藻RuBisCO基因5'端上游啟動子區(qū)域199bp的片段(pro);設計擴增綠色熒光蛋白(GFP)基因引物，以攜帶GFP基因的質(zhì)粒為模1板擴增GFP基因;以RuBisCO基因啟動子區(qū)域片段和綠色熒光蛋白基因（gf

3、p）片段為模板，通過重組PCR技術，得到含啟動子區(qū)域和GFP基因的DNA片段。
　　2重組PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體相連接。連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)大腸桿菌JM109。限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定重組克隆片段，最后測序驗證目的基因。
　　3檢測不同鹽濃度下pMD18-pro∷g/E.coli JM109轉化子的熒光強度。
　　4利用生物信息學方法對這一啟動子區(qū)域中可能存在的轉錄起始位點進行預測，使用步移缺失設計引物以獲得1

4、0段長度不等的pro-gfp片段，再克隆入pMD18-T載體并導入感受態(tài)大腸桿菌JM109。
　　5培養(yǎng)并觀察各突變個體中的綠色熒光蛋白表達情況。
　　6定點突變分析-35區(qū)六核苷酸(TTGACT)的精確位置。
　　結果：
　　1螺旋藻耐鹽相關基因啟動子PCR產(chǎn)物的片段大小為199bp，GFP基因PCR產(chǎn)物的片段大小為717bp，重組PCR的片段大小為916bp，與預期的結果吻合。
　　2重組PCR產(chǎn)物和p

5、MD-18T載體成功連接，并成功轉化入感受態(tài)大腸桿菌JM109，經(jīng)雙酶切鑒定和測序鑒定，序列正確無誤。
　　3實驗結果顯示LB液體培養(yǎng)基含0.2M、0.4M、0.6M和0.8M NaCl條件下，pMD18-pro∷gfp/E.coli JM109轉化子GFP的熒光水平均高于正常培養(yǎng)條件對照組(0.02M NaCl)，表明該啟動子可以被高濃度的鹽所誘導。
　　4 PCR擴增得到了上述重組產(chǎn)物的10條步移缺失片段，成功構建10個

6、缺失突變表達質(zhì)粒并轉化入感受態(tài)大腸桿菌JM109。
　　5突變體1-9均能發(fā)出綠色熒光，而突變體10不能發(fā)光。綜合上述實驗結果可推測出鈍頂螺旋藻耐鹽相關基因RuBisCO基因的核心啟動子區(qū)為第二種預測結果，即位于-94～-54bp之間，同時該區(qū)域內(nèi)的TTGACT與TATTTT序列分別相當于原核生物核心啟動子區(qū)的-35區(qū)與-10區(qū)。
　　6定點突變分析表明，當-35區(qū)TTGACT第六個核苷酸(T)改為A，啟動子的活性保持不變。

7、然而，當?shù)谝籘或第二T被突變后，啟動子的活性急劇下降;當-35區(qū)TTGACT與-10區(qū)TATTTT被插入或者刪除四個堿基，啟動子的活性急劇下降。
　　結論：
　　鈍頂螺旋藻耐鹽相關基因RuBisCO基因的核心啟動子區(qū)位于-94～-54bp之間，同時該區(qū)域內(nèi)的TTGACT與TATTTT序列分別相當于原核生物核心啟動子區(qū)的-35區(qū)與-10區(qū)，且這兩個區(qū)之間、以及TATTTT與轉錄起始位點之間相隔的位置均為最佳距離。當-35區(qū)TT