半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)性別決定的基因組學(xué)研究.pdf

1、半滑舌鰨是我國(guó)沿海特有的重要經(jīng)濟(jì)魚類。由于其雌雄生長(zhǎng)差異巨大,雄性個(gè)體生長(zhǎng)速度過慢加大了養(yǎng)殖成本,嚴(yán)重阻礙了半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化推廣。因此,解決半滑舌鰨雌雄比例問題,實(shí)現(xiàn)全雌化養(yǎng)殖對(duì)于半滑舌鰨產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。此外,半滑舌鰨性別決定系統(tǒng)為ZZ/ZW型,具有異型性染色體,并且發(fā)現(xiàn)存在天然性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。因此,半滑舌鰨也是研究魚類性別決定和分化的理想模型。本文圍繞半滑舌鰨的性別決定和分化,從大片段基因組文庫構(gòu)建及性別基因篩選、高密度遺

2、傳連鎖圖譜繪制及性別連鎖分析以及性逆轉(zhuǎn)的表觀基因組等基因組學(xué)研究的不同層面,初步分析了半滑舌鰨性別決定和分化的基因組學(xué)特點(diǎn),為半滑舌鰨性別決定機(jī)制的解析奠定了基礎(chǔ)。其主要結(jié)果如下:
　　1.以pECBACI為載體,用BamHI和.HindIII內(nèi)切酶構(gòu)建了2個(gè)高質(zhì)量的半滑舌鰨BAC文庫。2個(gè)BAC文庫共由55,296個(gè)克隆組成,空載率小于3.2％,平均插入片段約為156.4 kb,兩個(gè)文庫的覆蓋率約為半滑舌鰨單倍體基因組大小的13

3、.36倍。根據(jù)半滑舌鰨AFLP雌性特異標(biāo)記和性別相關(guān)基因設(shè)計(jì)Overgo探針,進(jìn)行同位素原位雜交,獲得228個(gè)陽性克隆,其中性別相關(guān)基因獲得陽性克隆76個(gè),平均每個(gè)基因陽性克隆為15.2個(gè),和BAC基因組覆蓋度基本一致;雌性特異標(biāo)記獲得陽性克隆152個(gè),平均每個(gè)標(biāo)記獲得陽性克隆30個(gè),為半滑舌鰨BAC基因組覆蓋度2倍多。利用.ABI3730常規(guī)測(cè)序獲得含有性別相關(guān)基因(Sox9、Dmnl和Cyp19ala)和雌性特異標(biāo)記(CseF382

4、)的5個(gè)BAC陽性克隆全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)度分別為127 kb(Sox9),145 kb(Dmrtl),165 kb(Dmrtl),107 kb(Cyp19ala)和135 kb(Cse382)。分析了含有Cyp19ala基因BAC全長(zhǎng)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(重復(fù)序列、GC含量、轉(zhuǎn)座元件等),從BAC序列預(yù)測(cè)了9個(gè)基因,其中7個(gè)為已知基因。利用青鱂、斑馬魚、三棘刺魚、紅鰭東方鲀和黑青斑河豚的基因組序列開展了Cyp19ala基因的比較分析,發(fā)現(xiàn)該基因在不

5、同魚類具有結(jié)構(gòu)和功能的保守性,主要包括所有魚類的Cyp19ala基因都具有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子;均含有5個(gè)保守的功能域;上游調(diào)控元件的保守性以及卵巢高表達(dá)的特異性等。
　　2.利用基于新一代測(cè)序技術(shù)的RAD-Seq構(gòu)建了半滑舌鰨高密度SNP遺傳連鎖圖譜,并開展了全基因組性別連鎖分析。首先利用HiSeq2000對(duì)半滑舌鰨父母本進(jìn)行了全基因組重測(cè)序,獲得reads數(shù)目分別為113 M和101M,測(cè)序深度分別達(dá)到16.8x和15.1x

6、,基因組覆蓋率達(dá)到92.8％和94.9％。經(jīng)過嚴(yán)格的篩選條件,獲得父本雜合位點(diǎn)(1:1),母本雜合位點(diǎn)(1:1)以及雙親雜合位點(diǎn)(1:2:1)SNP數(shù)目分別為407,084個(gè),397,300個(gè)和89,989個(gè),覆蓋scaffolds的數(shù)目分別為3,553個(gè),3,509個(gè)和1,925個(gè),總長(zhǎng)度分別為452 Mb,453 Mb和448 Mb,基因組覆蓋度達(dá)到96.2％,96.4％和95.3％。利用pstl酶切對(duì)F1代216個(gè)個(gè)體進(jìn)行了RAD

7、-Seq,測(cè)序深度為0.4x,reads數(shù)目從2,275,870個(gè)-11,639,889個(gè),平均為6,224,947個(gè)。經(jīng)過篩選獲得RAD-tag數(shù)目從699,271個(gè)-1,134,343個(gè),平均為913,371個(gè)。對(duì)F1群體基因分型的結(jié)果進(jìn)行分離比檢驗(yàn)(P=0.05),總共得到滿足分離比的13,116標(biāo)記,其中母本雜合的標(biāo)記為5,610,覆蓋scaffolds數(shù)目為1,018個(gè),總長(zhǎng)為396 Mb。父本雜合的標(biāo)記為6,428,覆蓋sc

8、affolds數(shù)目為1,03l,總長(zhǎng)為402 Mb。雙親雜合的1:1位點(diǎn)標(biāo)記為1,078,覆蓋scaffolds數(shù)目為636個(gè),總長(zhǎng)為304 Mb。利用Joinmap3.0軟件從滿足分離比的13,116個(gè)標(biāo)記均勻選取3,528個(gè)標(biāo)記,初步構(gòu)建了半滑舌鰨高密度SNP遺傳連鎖圖譜,包含22個(gè)連鎖群,其中常染色體連鎖群20個(gè),性染色體連鎖群2個(gè)。平均每個(gè)連鎖群含有遺傳標(biāo)記160個(gè),總圖距為1999.535 cM,平均間距為0.568 cM/m

9、arker。標(biāo)記覆蓋的scaffolds的總長(zhǎng)為422 Mb,約占基因組大小的88.4％。利用高密度SNP遺傳連鎖圖譜開展了性別的全基因組連鎖分析,發(fā)現(xiàn)其他染色體上的LOD值均在2.5以下,而W染色體上所有的標(biāo)記LOD值均顯著大于2.5,加性效應(yīng)均為負(fù)值,表明w染色體上等位基因與半滑舌鰨性別決定具有顯著關(guān)聯(lián)性。
　　3.利用全基因組甲基化測(cè)序(WGBS)繪制了半滑舌鰨單堿基分辨率的全基因組甲基化圖譜,初步揭示了半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的表觀

10、遺傳機(jī)制。利用IlluminaHiSeq2000完成了半滑舌鰨正常雌魚、正常雄魚和偽雄魚性腺的WGBS,獲得有效數(shù)據(jù)16.81 Gb,21.15 Gb和18.63 Gb,單鏈的覆蓋深度分別達(dá)到19.65x,25.39x和21.60，mCs約占基因組中所有胞嘧啶的8.67％、8.86％和8.76％。97％以上的甲基化位點(diǎn)都發(fā)生在CpG區(qū)域,并且絕大多數(shù)mCs都具有較高的甲基化水平。半滑舌鰨基因TSS兩側(cè)區(qū)域具有較低的甲基化水平,而在基因編

11、碼區(qū)、內(nèi)含子以及3'UTR區(qū)域均具有較高的甲基化水平。所有的轉(zhuǎn)座元件(DNA、LINE、SINE、LTR等)均呈現(xiàn)出與基因組相似的甲基化水平,而簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Repeat)和隨機(jī)重復(fù)序列(Tandom Repeat)則呈現(xiàn)出較低的甲基化水平。此外,在各種小RNA區(qū)域,則表現(xiàn)出不同的甲基化水平,在snRNA的下游區(qū)域具有較高的甲基化水平,在rRNA和tRNA區(qū)域甲基化水平相對(duì)基因組整體較低,而在miRNA區(qū)域則表現(xiàn)出與基因組

12、甲基化類似的水平。根據(jù)mCs所在的位置,將半滑舌鰨基因分為甲基化基因和非甲基化基因,在正常雌魚、正常雄魚和偽雄魚中,甲基化的基因?yàn)?0,237個(gè)、20,183個(gè)和20,199個(gè),占所有基因的97.03％,96.77％和96.85％,非甲基化的基因僅為619個(gè)、673個(gè)和657個(gè)。偽雄魚和正常雄魚基因組甲基化水平整體較為相似,均具有較高的甲基化水平,而與正常雌魚的差異顯著。正常雌魚和正常雄魚的DMRs達(dá)到了14.87 Mb,正常雌魚和偽雄