非程序性dna合成試驗

1、1范圍本方法規(guī)定了非程序性DNA合成試驗的基本技術(shù)要求。本方法適用于評價保健食品的誘變性和或致癌性。用這種短期篩選方法可以檢測出一些短期體外試驗法所不能檢出的誘變劑和或致癌劑。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本方法。非程序性DNA合成（UnscheduledDNASynthesis，UDS）：當(dāng)DNA受損傷時，損傷修復(fù)的DNA合成主要在S期以外的其它細(xì)胞周期，稱非程序性DNA合成。3原理正常情況下，于細(xì)胞有絲分裂周期中，僅S期是DNA合

2、成期。當(dāng)DNA受損傷時，損傷修復(fù)的DNA合成主要在其它細(xì)胞周期，稱程序外DNA合成，即UDS，因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過損傷。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，用UDS的測量來顯示DNA修復(fù)合成的主要關(guān)鍵在于如何鑒別很高水平的半保留DNA復(fù)制和水平較低（充其量只有半保留DNA復(fù)制的5％）的UDS。這可以用同步培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于G1期并用藥物（常用羥基脲）抑制殘留的半保留DNA復(fù)制后顯示。同步培養(yǎng)可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培養(yǎng)基（ADM）使DN

3、A合成的始動受阻而使細(xì)胞同步于G1期。在這些半保留DNA合成明顯抑制和阻斷了的細(xì)胞中，UDS即可用3H胸腺嘧啶核苷的摻入增加顯示。它可用放射自顯影或液體閃爍計數(shù)法進(jìn)行測量。4試劑與器材4.1試劑全部試劑除注明外，均為分析純，試驗用水為雙蒸水。4.1.1參考陽性物對照物：可用712二甲基苯并蒽（712dimethylbenzathracene），2乙酰氨基芴（2acetylaminofluene），4硝基喹啉氧化物（4nitroquino

4、lineoxide），N甲基亞硝胺（Ndimethylnitrosamine）。細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基：Eagle氏最低要求培養(yǎng)基（MinimalEssentialMedium，簡稱EMEM）85份，小牛血清15份，加入青霉素、鏈霉素貯存液1份，使青霉素、鏈霉素的最終濃度分別為100單位及100mgmL。EMEM培養(yǎng)基可選用各種商品供應(yīng)之粉末培養(yǎng)基按生產(chǎn)廠商提供資料配制并除菌。4℃冰箱貯存。4.1.2同步用培養(yǎng)基：不含精氨酸之Eagle氏ME

5、M培養(yǎng)基（ADM）98份，小牛血清2份，青霉素、鏈霉素濃度同細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基。4.1.3Hanks平衡鹽溶液（HBSS）貯液A：將氯化鈉160g，氯化鉀8g，硫酸鎂（MgSO4?7H2O）2g及氯化鎂（MgCl2?6H2O）2g溶于800mL雙蒸水（50～60℃）中。另取無水氯化鈣2.8g溶于100mL雙蒸水中。將上述兩溶液混合后，加水至1000mL，加入三氯甲烷2mL，保存于4℃冰箱中。貯液B：將磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O

6、）3.04g（或Na2HPO4?2H2O1.2g）、磷酸二氫鉀（KH2PO4?2H2O）1.2g（或KH2PO40.95g）、葡萄糖20g溶解于800mL雙蒸水中，加入100mL0.4％酚紅溶液（取酚紅1g，溶于3mL1molL氫氧化鈉中，待完全溶解后，加入雙蒸水中至250mL），加水至1000mL，加入三氯甲烷2mL，保存于4℃冰箱中。貯液C：1.4％碳酸氫鈉以雙蒸水配制。應(yīng)用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分裝于玻璃

7、容器內(nèi)；高壓滅菌，類及帶橡皮塞之玻具應(yīng)用高壓滅菌120℃30min。溶液除不耐熱的應(yīng)用抽濾除菌外，耐熱的可用高壓滅菌，一般用115℃10min。5操作步驟5.1細(xì)胞的傳代、維持和貯存用于化學(xué)致癌物在體外培養(yǎng)細(xì)胞中誘發(fā)UDS的實驗研究的哺乳類細(xì)胞的種類很多。人類細(xì)胞的UDS反應(yīng)大于嚙齒類細(xì)胞。在化學(xué)致癌性檢測試驗中很多人使用人類細(xì)胞。這有一個可取的優(yōu)點(diǎn)，即某一化學(xué)物質(zhì)對人類危害作評價時，可減輕因種屬差異而導(dǎo)致推論錯誤的風(fēng)險。使用最多的人類

8、細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，外周血淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和Hela細(xì)胞等。使用人羊膜細(xì)胞FL株，是一種上皮細(xì)胞系，且該羊膜細(xì)胞富含有可誘導(dǎo)的藥物代謝酶系。生長成單層的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基。用Hanks平衡鹽液（HBSS）洗滌后，用0.02％EDTA或0.1％胰酶溶液（于無Ca2、Mg2之磷酸鹽緩沖液中）于37℃下處理數(shù)min使細(xì)胞退縮，細(xì)胞間隙增加。再用HBSS洗滌1次，加入適量培養(yǎng)基，反復(fù)吹吸，使細(xì)胞自玻面上脫下并分散于培養(yǎng)基中。取細(xì)胞懸液一滴，加于血

9、球計數(shù)池中，計數(shù)四大格中的細(xì)胞數(shù)，計算出懸液中之細(xì)胞濃度（四大格的細(xì)胞數(shù)4104即為每mL所含細(xì)胞數(shù)）。將細(xì)胞懸液生長培養(yǎng)基稀釋至0.5～1105個mL。將上述細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中（30mL培養(yǎng)瓶可接種3mL。100mL的可接種10mL）。每次接種3份，長成融合單層后取其中一瓶再按以上方法傳代接種3瓶。另兩瓶在證明傳代成功后棄去或供實驗所用，這樣可保證細(xì)胞在實驗中延續(xù)保持。有條件可按下法將細(xì)胞貯存于液氮中。若較長時間不用，不必在實驗室

10、中維持。在需要時取出經(jīng)增殖后供實驗所用。將細(xì)胞增殖至所需數(shù)量后，按上法制成細(xì)胞懸液（于生長用培養(yǎng)基中）。細(xì)胞濃度為1～1.5106個mL。在冰浴中，逐漸加入為細(xì)胞懸液總量10％的滅菌二甲基亞砜。然后將細(xì)胞懸液分裝于潔凈干燥之滅菌安瓶或細(xì)胞凍存專用塑料小管中，每份1mL。封口后，置于4℃中2～3h，然后移至普通冰箱之冰室內(nèi)4～5h，再移入－30～－20℃之低溫冰箱內(nèi)過夜。次日晨將安瓶移入生物用液氮儲存器內(nèi)。需用時，將安瓶或小塑料管鋸（打）

11、開，除去含有二甲基亞砜的培養(yǎng)基，加入適量之生長用培養(yǎng)基，并調(diào)整細(xì)胞濃度至10～15104個mL。分種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)1h后，換培養(yǎng)基一次，將無活力之細(xì)胞除去，待長成融合單層后分傳增殖維持于實驗室中。5.2UDS的放射自顯影顯示法將細(xì)胞增殖至所需數(shù)量后，按上述方法制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸于生長用培養(yǎng)基（EMEM85小牛血清15）中。濃度為0.5～1105個mL。將上述細(xì)胞懸液接種于置有小蓋片（18mm6mm）之培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)

12、1～3天，使細(xì)胞在蓋片上生長至適當(dāng)密度。培養(yǎng)瓶接種數(shù)目根據(jù)檢品的數(shù)目、所選劑量級別而定。每一劑量作2～3個樣片，并另備4～6個樣本供溶劑對照和已知致癌物的陽性對照用。細(xì)胞在增殖培養(yǎng)后，按以同步培養(yǎng)用培養(yǎng)基（ADM補(bǔ)以1％小牛血清）作同步培養(yǎng)3～4天。在實驗前一日下午，加入溶于ADM之羥基脲（HU）溶液，使HU在培養(yǎng)基中之終濃度為10mmolL。繼續(xù)在37℃下孵育16h，然后將上述長有細(xì)胞之蓋片置于含有不同濃度之檢品、HU（濃度為10mm

13、olL）及3H胸腺嘧啶核苷（5～10mCimL，30CimmoL）之同步用培養(yǎng)基中。37℃中孵育5h。以溶劑及已知致癌物為對照。檢品及已知致癌物溶液在實驗時新鮮配制。先將它們?nèi)苡谶m當(dāng)之溶劑（蒸餾水、二甲亞砜、丙酮等）中，配成最高測試濃度100倍的儲液。再依次以溶劑按10倍稀釋，作成不同濃度之檢品溶液。將各種濃度的檢品溶液，加于培養(yǎng)基中，使溶劑的最終濃度為1％。應(yīng)同時設(shè)有陽性對照組和陰性對照組，包括加S9和不加S9兩種情況。孵育結(jié)束后，用

14、HBSS充分洗滌，用1％檸檬酸鈉溶液處理10min，隨后用乙醇冰乙酸（3∶1）固定（4℃）過夜，空氣中干燥后，用少量中性樹膠，將蓋片粘固于載玻片上，長有細(xì)胞的一面朝上，45℃烘烤24h。在暗室中，將適量之核4乳膠移入浸漬用之玻璃器皿中，置于40℃之水浴中令其融化，同時取等量之蒸餾水于一量筒中也置于該水浴中加熱，待乳膠融化后，將熱蒸餾水傾于乳膠液中，繼續(xù)在水浴中加溫，并用玻璃棒輕輕攪拌，等待10～20min，使氣泡逸出。在以上準(zhǔn)備過程中，