sars病毒m,n,s蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位

1、北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2003年）SARSCOVMNS蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位683SarsSars－CovCovM，NSNS蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位生命科學(xué)學(xué)院00級(jí)陸文摘要在獲得SarsCov的結(jié)構(gòu)蛋白SMN的cDNA的TEasy克隆之后通過限制性內(nèi)切酶處理后連接到表達(dá)載體上然后通過bactobac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)把結(jié)構(gòu)蛋白的DNA轉(zhuǎn)座到bac中轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞包裝出第一代病毒后用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞從細(xì)胞中純化到Sars

2、Cov的結(jié)構(gòu)蛋白.由于在PCR的設(shè)計(jì)的引物中在DNA末端加入標(biāo)記可以利用標(biāo)記的抗原性用westernblotting檢驗(yàn)得到的純化蛋白.在昆蟲病毒感染重組病毒48h之后免疫熒光制片觀察蛋白在細(xì)胞中的分布.同時(shí)將克隆到熒光蛋白載體的MN蛋白和真核表達(dá)載體的S蛋白轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞通過熒光蛋白的分布或免疫熒光確定MNS蛋白在真核細(xì)胞中的分步.關(guān)鍵詞：SarsCovSarsCov結(jié)構(gòu)蛋白MNS蛋白轉(zhuǎn)染westernblotting免疫熒光。前言冠狀

3、病毒科的成員只感染脊椎動(dòng)物與多種動(dòng)物和人的疾病有關(guān)本科病毒具有胃腸道呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)嗜性分別引起相應(yīng)的癥候群.冠狀病毒為多形態(tài)略成球形直徑80160nm.有囊膜.病毒囊膜由雙層脂質(zhì)組成在脂質(zhì)雙層中穿插有兩種糖蛋白:膜蛋白(M又稱E1)和纖突蛋白S(又稱E2).囊膜表面覆有長1224nm的突起(即纖突)纖突末端呈球狀由于囊膜纖突規(guī)則的排列呈皇冠狀冠狀病毒的名稱即由此而來.病毒粒子內(nèi)部為RNA和核衣殼蛋白(N)組成的核蛋白核心呈螺旋式結(jié)構(gòu)直

4、徑916nm.存在于病毒粒子囊膜上的糖蛋白具有不同的功能:M蛋白(2030KD)是一種轉(zhuǎn)膜糖蛋白它通過3個(gè)疏水α螺旋區(qū)3次插入脂質(zhì)雙層故其大部分(85%)位于囊膜內(nèi)部?jī)H有N端糖基化的小部分暴露在囊膜的外面.M的功能類似正粘病毒副粘病毒以及彈狀病毒的非糖基化蛋白在病毒裝配期間將核衣殼連接到囊膜上另外抗M抗體在補(bǔ)體存在時(shí)可中和病毒感染性.S糖蛋白(180200KD)大部分暴露在脂質(zhì)層外面是構(gòu)成囊膜突起的主要成分.它由2個(gè)同樣大小的多肽組成S

5、蛋白能直接與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合引起細(xì)胞融合并具有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和介導(dǎo)細(xì)胞免疫等功能.北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2003年）SARSCOVMNS蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位685圖2Fab示意圖SARS病毒基因組中總共找到了11個(gè)編碼序列（CDS，codingsequence）序列比對(duì)的結(jié)果顯示從第250位核苷酸開始編碼的長度為7074個(gè)氨基酸的多肽預(yù)測(cè)的開放讀碼框1ab多聚蛋白，和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus，MHV

6、)的相應(yīng)片斷很相似根據(jù)已有的鼠肝炎病毒相應(yīng)片斷的知識(shí)將預(yù)測(cè)的開放讀碼框1ab多聚蛋白又分成14個(gè)蛋白其中包括依賴RNA的RNA聚合酶.另外一個(gè)CDS(開放讀碼框1a多聚蛋白)，就是預(yù)測(cè)的開放讀碼框1ab多聚蛋白的前4383個(gè)氨基酸.其它9個(gè)CDS中有4個(gè)在BLAST中找到了高度同源的序列分別對(duì)應(yīng)于S蛋白、M蛋白、E蛋白、和N蛋白.5個(gè)沒有找到任何同源的序列.所以推定SARS病毒總共有23個(gè)蛋白質(zhì).N蛋白結(jié)合在一個(gè)已經(jīng)確定的病毒RNA包裝

7、的信號(hào)上引導(dǎo)螺旋狀排列的核衣殼的裝配.M定位在特殊的細(xì)胞質(zhì)膜泡上面向細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)上并且可以和E蛋白相互作用幫助核衣殼從膜上出芽.在某些冠狀病毒中M蛋白的C端和核殼體相互作用形成一個(gè)核心結(jié)構(gòu).S蛋白也可以和M相互作用使成熟的病毒粒子以膜泡的形勢(shì)釋放出去.S蛋白前體在宿主的細(xì)胞質(zhì)中合成以后會(huì)被切成兩個(gè)部分S1和S2其中S1形成成熟蛋白的球狀部分具體的切割位點(diǎn)并不清楚.一般情況下冠狀病毒的侵染過程需要宿主細(xì)胞膜受體的介導(dǎo).受體識(shí)別位點(diǎn)位于S1

8、的內(nèi)部.S2形成成熟蛋白的棒狀部分包括一個(gè)Nhelix、一個(gè)MHelix、一個(gè)CHelix和一個(gè)跨膜區(qū).S1和S2之間通過分子間作用力相互結(jié)合其結(jié)合位點(diǎn)可能有多個(gè).S2的跨膜區(qū)把整個(gè)Spike蛋白固定在病毒的囊膜上當(dāng)S1通過受體結(jié)合位點(diǎn)和宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合以后會(huì)導(dǎo)致S1和S2之間的分子間結(jié)合力減弱S1和S2分離.暴露出S2上的3個(gè)helixNHelixMHelix和CHelix可以穿過宿主細(xì)胞膜使得病毒的囊膜和宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合.S1和

9、S2之間結(jié)合力的強(qiáng)弱是影響冠狀病毒傾染性強(qiáng)弱的重要因素之一.特殊情況下如pH增高的時(shí)候S1和S2之間的相互作用被削弱在沒有受體作用的情況S1和S2也能分離S2進(jìn)一步介導(dǎo)病毒和細(xì)胞的融合(Kruegeretal.2000).Spike蛋白的受體屬于一個(gè)叫做carcinoembryonicantigencelladhesionmolecules(CEACAMs)的多向性家族(pleiotropicfamily)這是一個(gè)包含很廣泛的分子家族在