基因診斷genediagnosis中國醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學教研室李福才

1、1,第二節(jié) 基因治療（Gene theraphy ）,基因治療（gene theraphy ）：是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病以達到治療的目的。 為達到這一目的，實施相應的策略。,2,1、直接療法：糾正突變基因 也就是在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的。這種方法上較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)） 2、間接療

2、法：以正?；蛱娲虏』颉?導入外源正?；颍嬗腥毕莸幕?。對靶細胞而言，沒有去除或修復有缺陷的基因。 二者均是用DNA重組技術設法修復患者細胞中有缺陷的基因，使細胞恢復正常功能而達到治療遺傳病的目的。,3,途 徑,就基因轉(zhuǎn)移的受體細胞不同，基因　　　　　　　　治療有兩種途徑：　　　1、生殖細胞基因治療 2、體細胞基因治療,4,1、生殖細胞基因治療,理論上將正常細胞基因轉(zhuǎn)移到患者的生

3、殖細胞（精細胞，卵細胞早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。這是理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中播散。,5,但還存在某些問題：,1）靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質(zhì)性進展；　2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法；　3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動物，很難適用于人類?！。ǖ壳拜o助生殖技術的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）,6,2．體細胞基因治療（somatic c

4、ell gene therapy）,是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。,7,措 施：,（1）正常基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細胞，有效表達后，再回輸?shù)襟w內(nèi)。（2）正?；?qū)氚屑毎ㄎ徽系饺旧w上，準確的替換異?；颍抢硐氲拇胧?。（3）隨機整合，非特定座位，只要有效的表達即可達到治療的目的。（4）體細胞基因理論不必矯正所有的體細胞。,8,存在的問題：,（1）對特定座位基因

5、轉(zhuǎn)移，目前還存在較大困難；（2）隨機插入可能引起后代的基因突變。,9,基因治療的方法（The methods of gene therapy）,實施基因治療的第一個關鍵性步驟是 基因轉(zhuǎn)移 一、Gene轉(zhuǎn)移方法,10,1、正常基因的分離與克隆,基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離 經(jīng)克隆

6、 ↓ 定 位 ↓ 表 達 ↓ 評價表達情況,11,2、外源基因的轉(zhuǎn)移,通過不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細胞。,12,（1）化學法,磷酸鈣沉淀法： 目的基

7、因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內(nèi)，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達。方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA → 混合微細顆粒 （ Ca離子濃度 125 mmol， DNA 離子濃度 5～0ug/ml。 PH 7.0）

8、 ↓ 沉淀反應20~30min ↓ 細胞在沉淀物中暴露 5~24h,13,(2)物理方法,1、電穿孔法（electroporotion）將細胞至于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞，進而表達。

9、瞬間細胞 細胞膜核摸通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細胞,,,14,2、顯微注射法（microinjection ）,利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核中。,15,例：轉(zhuǎn)基因動物的制備,重組基因 DNA

10、 微注射 （體外） 小鼠受精卵

11、 回植 假妊娠

12、 仔 鼠

13、 動物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個鼠細胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳),,,,,,16,17,,clone sheep Dolly體細胞 提取 核 重組細胞 回植 Dolly卵細胞 去核

14、 細胞,,,,,,18,3、脂質(zhì)體法（liposome）,應用人工制備的類似細胞膜的膜性結構— 脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細胞融合，外源DNA導入靶細胞，使其表達。 DNA 胞融合 轉(zhuǎn)化細胞 PEG

15、仙苔病毒,,,,DNA,,,,,,脂膜,19,4．同源重組法,同源重組（homologus recombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。 是將外源基因定位導入細胞的染色體上。 單交換 雙交換,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,20,通過同源重組定點插入珠蛋白基因,,,,,,,,Xha I,BstXI,Xha I,,,,δ,β,△

16、β,neo,,,,XhaI,BstXI,,,,,,δ,Δβ,β,neo,正?；蜃?帶有珠蛋白基因的質(zhì)粒,,重組質(zhì)粒,C,重組后，插入外源基因外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細胞在含有neo 的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細胞死亡，將有重組的細胞篩選出來。,21,5.病毒介導基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viral mediated transfer）,是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后

17、去感染受體細胞。圖：,,感染細胞,重組病毒,22,逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) 常用的病毒載體 DNA病毒 1)逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus） 目前應用最多的最成功的是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒感染細胞后，其基因組RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病

18、毒顆粒。 完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的全套酶系統(tǒng)，適用于介導基因轉(zhuǎn)移。,,23,24,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結構：,LTR LTR ψ gag pol envU5 R U3

19、 U5 R U3 U3=增強子，R=啟動子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點。 Ψ=病毒包裝信號，gag =核心抗原，pol=逆轉(zhuǎn)錄酶， env=外殼蛋白。,,,,,,,,,,,,,,,,,,25,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點：,①高效感染宿主細胞，轉(zhuǎn)染率可達100%；②病毒基因和所載的外源基因都可能表達；③宿主范圍廣，可同時感染大量細胞并長期存留,26,缺 點,①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左

20、右片段； ②病毒隨機插入靶細胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達或失活，插入的 外源基因可能不適當?shù)谋磉_； ③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致病作用，可能使受體細胞癌變。 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號。,27,二、靶細胞的選擇,是指接受外源Gene的體細胞，選擇靶細胞的原則是：1）必須較堅固，便于體外培養(yǎng)和進行遺傳技術操作；2）易于

21、由人體分離又便于輸回體內(nèi)， 具有增殖優(yōu)勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，或整個生命周期；3）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。,28,某些代表性細胞,外周血T淋巴細胞、皮膚成纖維細胞較符合上述要求。此外，造血干細胞——β地中海貧血、嚴重復合免疫缺陷病等基因治療。肝C——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的 基因治療。,29,基因治療存在的問題與論理學,基因 治療的研究與實踐中存在若干重要問題，所以更多的是處于研究階段，臨床應用還有待

22、深入。,30,一、導入基因的持續(xù)性和高效表達,如何提高基因的持續(xù)高效表達，從下列幾方面考慮： 1、選擇高效的基因轉(zhuǎn)移方法； 2、選擇適當?shù)氖荏w細胞（生命周期長的細胞） 3、選擇適當?shù)妮d體（廣泛表達或特異性表達的載體，以使Gnen高效表達）,31,二、Gene治療與社會倫理道德,體細胞Gene治療符合倫理道德，沒有爭議。生殖細胞Gene治療可能改變正常人的遺傳特征，存在某些爭議。然而生殖細胞的基因治療又是一個不容回避的課

23、題，因為它比體細胞基因治療更為徹底。所以，隨著分子生物學技術的發(fā)展，Gen治療技術的成熟，將回答倫理道德方面的問題，相信生殖細胞的基因治療將會被人們接受。,32,三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景,體細胞Gene治療臨床實驗已經(jīng)開始，生殖細胞Gene治療正在完善。進行基因治療必須具備下列條件：,33,具備下列條件,選擇適當?shù)募膊?，清楚疾病的發(fā)病機理，Gene的結構和功能。被糾正的基因已克隆，并清楚Gene表達與調(diào)控機制與條件。選擇

24、適當?shù)氖荏w細胞并在體外有效表達。安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法，以及供利用的動物模型。,34,基因治療實例,1、復合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）。ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。,35,ADA-Gene + vector （逆轉(zhuǎn)錄病毒） 重組分子 患者T Ly C IL-2刺激

25、C分裂 導入 細胞生長分裂 10天 Gene表達 回輸患兒體內(nèi) 1~2月治療一次10個月患兒體內(nèi)ADA水平達正常人的25%,,,,,,,,36,2、乙型血友病,XR ，患者

26、凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3～q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術后常出血不止。發(fā)病率為1/30　000。例如：我國學者薛京倫實施的FⅨ的基因治療。,37,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 +FⅨcDNA 重組體 5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`①導入倉鼠細胞（CHO ）→FⅨ表達；②導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞

27、（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達；③91年，導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達，F(xiàn)Ⅸ基表達水平達正常人的5%。 是我國基因治療成功的例子。,,,,,,,,,,,,,,,38,3、黑色素瘤的基因治療,腫瘤Gene治療是人們十分關注的問題，進行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點協(xié)助治療腫瘤。,39,例：細胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治

28、療,①IL-2 Gene ②TNF-Gene （白介2） （腫瘤壞死因子） 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

29、 導入 TIL（體外培養(yǎng)的自體細胞） 回植患者體內(nèi) TIL進入自體腫瘤部位，提高細胞因子殺傷腫瘤細胞 的作用。,,,,,,40,4、自殺基因的基因治療,原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎緩秃衔?，進而殺傷腫瘤細胞（腫瘤細胞不能復制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中

30、表達，而正常細胞中不表達。,41,如：自殺基因 + 病毒載體 轉(zhuǎn)染 重組載體,,,藥物前體 無毒Gene→酶→ ↓　　　　 藥物復合物 有毒,,

31、細胞死亡,42,例如： 單純皰疹病毒 哺乳動物細胞 HSV Gene-TK （在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達） Gene—TK GCV（胸苷類似物）

32、 TdR P p

33、 GCV---p 抑制DNA合成 脫氧胸苷酸 腫瘤細胞死亡 鄰近細胞死亡/凋亡（旁觀者效應）,,,,,,,,43,5、反義核酸基因治療,反義技術：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導入靶細胞，阻斷Gene的轉(zhuǎn)錄或復制，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的Gene不能轉(zhuǎn)錄為

34、mRNA 或阻斷翻譯相應蛋白.,44,反義基因治療,DNA DNA RNA RNA

35、 反義RNA

36、 阻斷表達,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,45,目前采用的技術：,反義RNA表達載體Vector Cell 轉(zhuǎn)錄RNA 阻斷mRNA反義RNA/DNA體外微注射質(zhì)脂體運載反義RNA；其他方法 Cacl2沉淀方法，細胞打孔儀，逆轉(zhuǎn)錄病毒導入方法。,46,醫(yī)學遺傳學考試形式簡介 一 、選擇題（20題，每題0.5分，共10分）