分子生物學技術課件

1、分子生物學技術,分子雜交與印跡技術Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。,一、分子雜交與印跡技術的原

2、理,（一）印跡技術,利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。,用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,（二）探針技術,二、印跡技術的類別及應用,（一）DNA印跡 (Southern blotting

3、),（二）RNA印跡 (Northern blotting),（三）蛋白質的印跡 (Western blotting),用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質定性定量及相互作用研究。,其他：斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點陣 (DNA array) DNA芯片技術 (DNA chip),三種印跡技術

4、的比較,分子雜交實驗,①,②,③,,,放射自顯影照片,DNA芯片技術,PCR技術的原理與應用The Principle and Application of PCR Technology,,5?,Primer 1,,5?,Primer 2,,,,5?,5?,Template DNA,,一、PCR技術的工作原理,,,,,,,,,,,,,,PCR技術原理示意圖,PCR的基本反應步驟,變性95?C,延伸72?C,退火Tm-5?C,,,

5、,,模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+,PCR體系基本組成成分,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。,二、PCR技術的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基

6、因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。,PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。,PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性 。,（四）DNA序列測定,（五）基因突變分析,逆轉錄PCR(reverse

7、 transcription PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉錄反應和PCR反應聯(lián)合應用的一種技術。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉錄PCR技術,三、幾種重要的PCR衍生技術,原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原

8、位PCR方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術,（三）實時PCR技術,實時PCR(real-time PCR)技術通過動態(tài)監(jiān)測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,實時PCR技術原理,實時PCR分類：,圖20-3 TaqMan探針法實時PCR原理示意圖,基因文庫Gene Library,基因組DNA文庫 (genomic DNA

9、 library)cDNA文庫(cDNA library),基因文庫(gene library),是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構建基因組文庫的載體有?噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,基因組文庫和cDNA文庫的構建和篩選,第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫篩選結果舉例

10、,cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經逆轉錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。,二、cDNA文庫,生物芯片技術Biological Chip Technique,是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，

11、從而迅速得出定性和定量的結果。該技術亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),基因芯片工作流程示意圖,是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。,二、蛋白質芯片,蛋白質分子間的親和反應,蛋白質芯片(protein chip),蛋白質芯片作用原理,生物大分子相互作用研究

12、技術 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白質相互作用研究技術,酵母雙雜交各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉換效應分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,常用蛋白質相互作用的研究技術,標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。,（一）標簽蛋白沉淀,標簽融合蛋白結合實驗主要用于證明兩種蛋白分

13、子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子。,標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖,（二）酵母雙雜交技術的基本原理和用途,酵母雙雜交系統(tǒng)的應用,證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的的相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選

14、未知的相互作用蛋白質。,（三）免疫共沉淀技術的基本原理和用途,免疫沉淀（immunoprecipitation IP） 免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP） 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在

15、完整細胞內生理性相互作用的有效方法。CO-IP與質譜分析 以細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜鑒定靶蛋白的結合蛋白,免疫沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,蛋白A ， 蛋白B 抗A抗體C進行洗脫抗B抗體D進行驗證,CO-IP與質譜分析流程,,電泳遷移率變動測定(electrophoretic mobility shift assa

16、y，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gel shift assay)最初用于研究DNA結合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前這一技術也被用于研究RNA結合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。,二、DNA-蛋白質相互作用分子分析技術,（一）電泳遷移率變動測定,凝膠遷移實驗結果示意圖,染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP

17、)是目前可以研究體內DNA與蛋白質相互作用的主要方法。,（二）染色質免疫沉淀法,染色質免疫沉淀實驗流程及結果示意圖,二、RNA-蛋白質相互作用分子分析技術,RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。應用范圍：研究蛋白與DNA動態(tài)作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關系研究蛋白與RNA的相互作用,激光共聚集顯微鏡

18、應用技術Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM),激光經放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時，焦平面上被激光掃描的點F所發(fā)出的一定波長的熒光通過檢測針孔光欄達到檢測器，并成像于顯示器上，得到相應的熒光圖象。,激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖,人眼及各類顯微鏡分辯率,人眼分辯率 0.20mm光學顯微鏡分辯率 0.25um共焦顯微鏡分辯率

19、 0.18um電子顯微鏡分辯率 0.20nm激光共聚焦顯微鏡有四個熒光通道，一個透射光通道,激光共聚焦顯微鏡的應用,定位、定量三維重組動態(tài)測量 ? 活細胞或組織內游離Ca2+分布和濃度的變化 測量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) ?自由基的檢測 ?藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 ?蛋白質的轉