rna提取及pcr相關(guān)技術(shù)

1、RNA提取及PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù),RNA提取逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果分析PCRqPCR,內(nèi)容,從RNA提取到基因定性/定量流程,收集并保存組織、血液、細(xì)胞等臨床樣本,,,,樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊， 每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好， 立即放置液氮罐中速凍1小時(shí)，-80℃冰箱保存。注意做

2、好標(biāo)記，避免反復(fù)凍融,第一部分 RNA提取,RNA提取樣本保存要求,細(xì)胞：不建議保存。 培養(yǎng)處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中- 80 ℃保存。血液：不建議長(zhǎng)期保存。 或立即分離白細(xì)胞后，于Trizol液中 - 80 ℃保存。,試劑耗材準(zhǔn)備工作,目的：去除RNase，防止RNA降解? 各種離心管、Tip頭、冷凍保存

3、管等塑料器皿：浸泡在0.1%的DEPC水中，過(guò)夜處理，次日烘干，高壓滅菌后再次烘干。? 錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術(shù)剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品： 用錫箔紙嚴(yán)密包裹后，150℃高溫烘烤4小時(shí)。,前期準(zhǔn)備工作,? RNase-free水：0.1％DEPC處理去離子水過(guò)夜，次日高壓滅菌除去 殘留DEPC，分裝1.5ml Eppend

4、orf管， 4℃保存。? 75％乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4℃保存。? 氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇：新包裝開(kāi)封后，分裝50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。,樣本準(zhǔn)備,組織,50－100mg 組織對(duì)應(yīng)1ml Trizol,樣本準(zhǔn)備,細(xì)胞 ? 懸浮細(xì)胞：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)后， 5000×g，5min離心去 除培養(yǎng)基，收集約5 - 10&

5、#215;106個(gè)細(xì)胞。 每5 - 10×106個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)1ml Trizol ? 貼壁細(xì)胞：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)后，收集約5 - 10×106個(gè)細(xì) 胞，倒掉培養(yǎng)基，加入預(yù)熱PBS洗一次，去 除PBS。 每10cm2培養(yǎng)面積對(duì)應(yīng)1ml Trizol,RNA的提取,注意佩戴口罩、勤更換手套 組織（1）液氮

6、預(yù)冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內(nèi)加入1ml Trizol繼續(xù)研磨，至呈不黏稠液態(tài)；（4）將混合液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管，室溫孵育5min；,裂解,,,,RNA的提取,細(xì)胞 懸浮細(xì)胞：離心收集后，倒除培養(yǎng)液，加入1ml Trizol 反 復(fù)吹打細(xì)胞，至溶液

7、不黏稠。 貼壁細(xì)胞：倒除培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后，直接在培養(yǎng) 瓶或培養(yǎng)板中加入1ml Trizol 反復(fù)吹打細(xì)胞， 直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管,裂解,,,,Trizol勻漿孵育后,RNA提取優(yōu)化步驟,（1）對(duì)得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20

8、 度過(guò)夜孵育，以增加得率。（2）對(duì)多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入 高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl）， -20度過(guò) 夜共孵育，以去除多糖物質(zhì)的污染。注意：所有試劑均需無(wú)酶水配制。,RNA鑒定及初定量,（1）測(cè)量OD值——得率及純度檢測(cè) 得率 總RNA濃度（ug/ml）＝OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

9、 （通常OD260 數(shù)值介于0.15-1.0之間才可靠） 純度 OD260/280檢測(cè)RNA純度 值在1.8-2.1之間，RNA純度較好； 值小于1.8，表明蛋白雜質(zhì)較多； 值大于2.2，表明RNA已降解；,RNA鑒定及初定量,（2）瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定

10、 1－3ul RNA溶液上樣，1％膠，100V電泳10min。完整RNA呈現(xiàn)明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時(shí)也可見(jiàn)5S帶,RNA鑒定及初定量,Electrophoresis gel of the RNA sample,小結(jié)－RNA的保護(hù),1. 提取前 1.1 新鮮樣品及液氮速凍 1.2 提取工作區(qū)RNase的清除 1.3 實(shí)驗(yàn)用品RNase的清除

11、 2. 提取中 2.1 組織破碎過(guò)程中的保護(hù) 2.2 細(xì)胞裂解過(guò)程中的保護(hù) 2.3 實(shí)驗(yàn)人員保護(hù)措施 2.4 保存過(guò)程中,3. 在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中仍需保持無(wú)酶環(huán)境,第二部分 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄,? 選擇方法： 兩步法（適用于多目的基因） 一步法（適用于單一目的基因）,RNA逆轉(zhuǎn)錄,? 選擇逆轉(zhuǎn)錄引物：隨機(jī)

12、引物（適用于低豐度RNA） Oligo (dT)引物（適用于具有Poly A尾的RNA） 特異性引物 （適用于一步法）,RNA逆轉(zhuǎn)錄步驟,（1）取1-5ug RNA樣本，65℃熱變性10min；（2）配制反應(yīng)體系，共20ul （以AMV為例）10×buffer

13、 2 ulMgcl2 (25mM) 4 uldNTPs (10mM) 2 ulRNase inhibitor(1U/ul) 0.5 ulreverse transcriptase 15 Ureverse primer 0.5 ugRNA sample

14、 1 -5ugRNase-free Water 加至 20 ul,一、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),RNA 逆轉(zhuǎn)錄步驟,（3）反應(yīng)體系42℃孵育60min。如使用隨機(jī)引物，先室溫孵育 10min后，再升溫至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)或-20 ℃保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn),,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)

15、以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以反應(yīng)底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。,PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,PCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作： ? 目的基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：NCBI中查詢(xún)靶基因的mRNA序列，無(wú)特 殊要求可選擇CDS序列作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域。,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,? mRNA序列查找（以E

16、GFR為例）,,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,…………,…………,…………,以BLAST驗(yàn)證引物,,,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,PCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作： ? 選擇內(nèi)參： 1. 受不同實(shí)驗(yàn)處理因素時(shí)，表達(dá)恒定； 2. 在體內(nèi)各種組織中表達(dá)恒定； 3. 除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理因素之外，能夠與目的基因 一起受同等程度的非設(shè)計(jì)其它

17、因素影響。 常用內(nèi)參基因名稱(chēng)： β-actin、 GAPDH、16Sr、18Sr （Human 、Rat 、 Mouse）,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟,二、PCR擴(kuò)增（示例）,cDNA第一鏈 2 ul10×PCR buffer(K+) 5 ul25mM MgCl2

18、 3 ul (1.5 mM)10mM dNTPs 1 ul (各200 uM)50μM引物 正向/ 反向 各0.5 ul (0.1~0.5 uM)Taq 酶 0.5 ul (1~5U)雙蒸水

19、 38.5 ul總反應(yīng)體積： 50 ulPCR mix包含：buffer（Mg2+） dNTPs Taq酶,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟,PCR反應(yīng)條件95 ℃ 2 min95 ℃ 30 sec40-65 ℃10-120 sec22-35cycle72 ℃60-120 sec72 ℃ 10min12 ℃

20、 ∞退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應(yīng)超過(guò)4-6℃。特異性的改進(jìn)：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時(shí)間。過(guò)長(zhǎng)的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會(huì)增加非特異性引物雜交的可能性。,,注意事項(xiàng),（1）每次PCR設(shè)立對(duì)照組和陰性對(duì)照組。（2）科學(xué)做法是將內(nèi)參引物加入目的基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增作為對(duì)照。（3）將反應(yīng)體

21、系中的相同試劑預(yù)先混合，再分裝成各 反應(yīng)管。（4）設(shè)定合適的循環(huán)次數(shù)，PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期。（5）在一定范圍內(nèi)調(diào)整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫 度，消除非特異性擴(kuò)增。,結(jié)果鑒定,瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果： 2％瓊脂糖凝膠，取4-8 ul產(chǎn)物上樣，60V電泳40min， 紫外燈下觀察結(jié)果。 采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描，測(cè)定灰度值。注意：灰度掃描

22、時(shí)，選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的 背景灰度值。,基因表達(dá)的差異分析－相對(duì)定量,各反應(yīng)體系以?xún)?nèi)參基因?yàn)閰⒄眨?jì)算待測(cè)基因產(chǎn)物與其灰度比值，作為待測(cè)基因的表達(dá)值。即待測(cè)基因產(chǎn)物電泳帶灰度值內(nèi)參基因產(chǎn)物電泳帶灰度值 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：待測(cè)樣本基因相對(duì)表達(dá)量 參照樣本基因相對(duì)表達(dá)量,,＝,待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量,,結(jié)果示例,,結(jié)果示例,熒光定量PCR (Real

23、-time PCR, qPCR),PCR + 熒光探針/ 熒光染料①應(yīng)用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá) 研究、病原體檢測(cè)及PCR條件的優(yōu)化等。②可定量原理：經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而 達(dá)到定量目的。③無(wú)須凝膠電泳：只須反應(yīng)管內(nèi)直接檢測(cè)。④減少污染環(huán)節(jié)：全封閉反應(yīng)管。 ⑤結(jié)果重現(xiàn)性

24、好：定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級(jí)。,Real-time PCR,相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖,起始拷貝數(shù)越高，Ct值越??；起始拷貝數(shù)越低， Ct值越大,與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光,游離時(shí)不發(fā)光,一種DNA小溝結(jié)合染料,1．SYBR? Green I,熒光染料,在PCR過(guò)程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光,聚合完成,聚合開(kāi)始,SYBR? Green I,每形成一個(gè)DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總

25、數(shù)目成正比,數(shù)量關(guān)系,一條探針，兩條引物 引物位于探針的兩邊一條探針，兩個(gè)基團(tuán) 前邊是報(bào)告基團(tuán)，后邊是淬滅基團(tuán),２．TaqMan探針/水解探針,每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比,數(shù)量關(guān)系,Real-time PCR反應(yīng)體系,cDNA第一鏈 2 ul10μM引物 正向/ 反向 各1 ul (0

26、.1~0.5 uM)2×SYBR Green qPCR Mix 10ul 雙蒸水 7 ul 總體積 20 ulSYBR Green qPCR Mix包含： SYBR Green 、buffer（Mg2+）、

27、 dNTPs、 Taq酶,Real-time PCR的定量方式,絕對(duì)定量：通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量：用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表 達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。結(jié)果分析△ △Ct法：目的基因與管家基因（內(nèi)參）擴(kuò)增效率