rna提取細節(jié)

1、RNA提取提取RNA提取前的準備提取前的準備RNA制備的關鍵是要抑制細胞中的RNA分解和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施：戴一次性手套，使用RNA操作專用實驗臺，在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。使用器具使用器具盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應在使用前按下列方法進行處理：（1）用0.1%DEPC水溶液在37℃下處理12小時，（2）然后在1

2、20℃下高溫滅菌30min以除去殘留的DEPC，RNA實驗用的器具建議專門使用，不要用于其他實驗。試劑配制試劑配制用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或使用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗用的試劑和無菌水都應專用，避免混用后交叉污染。實驗操作實驗操作在研磨樣品前，先把所要用到的試劑和槍頭

3、、研缽（未拆開報紙）放在超凈工作臺上，在研磨樣品前，先把所要用到的試劑和槍頭、研缽（未拆開報紙）放在超凈工作臺上，打開紫外燈照射打開紫外燈照射2030min殺菌。殺菌。1.50100mg的普通組織樣品：的普通組織樣品：RNAisoPlus1ml2.試驗樣品的研磨和勻漿試驗樣品的研磨和勻漿動物組織和植物組織材料樣品（1）將超低溫凍結的RNA提取樣品稱量后迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研缽研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明

4、顯的課件顆粒，如果沒有研磨徹底會影響RNA的收率和質量）。（研磨好的樣品立即加入RNAisoPlus）（2）對于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的RNAisoPlus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。（3）將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5min。（4）12000g4℃離心5min。（5）小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉淀）。3.TotalRNA的提取

5、的提?。尤耄尤隦NAisoPlus后，靜置后，靜置5min，離心轉移上清，避免未破碎的雜蛋白污染），離心轉移上清，避免未破碎的雜蛋白污染）（1）向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的15體積量），蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s（氯仿沸點低，易揮發(fā)，振蕩時應小心離心管突然彈開）。待溶液充分乳化（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5min。（2）12000g4℃離心15min。（3）從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為

6、三層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。（4）向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在1530℃下靜置10min。DntpMixture(10mMeach)2ulPrimerF0.5ulPrimerR0.5ulTakaRaEXTaqTMHS(5Sul)0.5ul上述的反轉錄反應液≤5ulRnaseFreeDh2OUpto50ul（上下游引物以配制在

7、一起，一個樣吸取1ul即可，根據(jù)樣品個數(shù)配制相應的大體系）（2）反應條件94℃1min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1minSBE1、SBE3引物使用Primerprimer5.0引物設計軟件設計。SBE1引物序列:上游引物5’CAGCCTGCTTCACCTACC3’，下游引物5’GCTCCAGTTGTTGCCTTC3’.SBE3引物序列：上游引物5’ATGCTAGAGTTTGACCGC3’下游引物5’AGTGT

8、GATGGATCCTGCC3’其中，SBE1的退火溫度是55.8，SBE3的退火溫度是60.以Actingene為內標，調節(jié)樣品RNA濃度一致，點樣跑電泳，得出電泳圖。PCR產物的電泳檢測1.5%PCR電泳膠的制備：1.5g瓊脂糖，100ml1TAE溶液，微波爐中加熱至完全溶解，冷卻到60℃左右，加入5ulGoldview，搖勻。倒板，冷卻成型即可點樣。點樣及電泳：1ul6LoadingBuffer和5ulPCR產物，混勻后點入凝膠孔中