分子生物學(xué)實驗原理

1、分子生物學(xué)實驗原理,,,,第一節(jié) 分子生物學(xué)發(fā)展概述,分子生物學(xué)molecular biology是在分子水平上研究生物的結(jié)構(gòu)、組織和功能的科學(xué)。1950年，Astbury在一次學(xué)術(shù)報告中，首次提出并使用了分子生物學(xué)這一名詞術(shù)語。廣義和狹義之分醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和理論來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調(diào)控的分子機理。,分子生物學(xué)理論與實際應(yīng)用的成就理論方面1.關(guān)于腫瘤的發(fā)生： 提出了腫瘤起源于細胞增殖和分化

2、調(diào)控的失常和細胞同它周圍組織關(guān)系的紊亂。 癌基因：100多種；抑癌基因：20多種 細胞周期調(diào)控系統(tǒng) 細胞凋亡 端粒酶,2.關(guān)于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗3.關(guān)于慢性病chronic disease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因及其多態(tài)性。4.關(guān)于生長、發(fā)育與進化的統(tǒng)一理論，也深入到了分子水平。,實際應(yīng)

3、用方面,,1.轉(zhuǎn)基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植物的基因有100多個。抗除草劑、抗昆蟲、抗病毒、抗不良環(huán)境因素（抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)常?、提高作物的產(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。,2.轉(zhuǎn)基因動物 1983年，超級小白鼠，體重是正常鼠的2倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬、羊、雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研究了金魚、鯉魚、圓頭魴。3.基因工程多肽藥物與疫苗 主要指DNA體外重組技術(shù)所研制的產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動物和植

4、物所研制的產(chǎn)品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改進的產(chǎn)品。,4.基因診斷與基因治療 基因診斷gene diagnosis是指通過直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從而對疾病作出診斷的方法。 目的物：DNA或RNA 方法：核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、 DNA芯片技術(shù) 疾?。哼z傳性疾??；傳染病或感染性疾病,基因治療gene therapy

5、指將正常的外源基因?qū)肷矬w靶細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因，關(guān)閉或降低異常表達的基因，以達到治療疾病的目的。治療疾?。?遺傳病 惡性腫瘤 傳染病,5.環(huán)境監(jiān)測與凈化 area survey and depollution 監(jiān)測：可檢測環(huán)境中的病毒和細菌 凈化：改造細菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農(nóng)藥和有毒金屬6.克隆動物Clone animal 1997年“多利”克隆羊 克隆器官（干

6、細胞stem cell技術(shù)）,7.人類基因組計劃human genome project;HGP1990年，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH） 和美國能源部聯(lián)合發(fā)表了人類基因組計劃。30億個堿基對，估計有3萬～4萬個人類基因。2000年6月26日，首次繪成人類基因組“工作框架圖” 。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學(xué)家及領(lǐng)導(dǎo)人宣布人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。,意 義與“阿波

7、羅”登月計劃相媲美1996年諾貝爾化學(xué)獎得主羅伯特·柯特認為，20世紀是物理學(xué)和化學(xué)的世紀，21世紀將是生物學(xué)的世紀。推動分子生物學(xué)更加快速地發(fā)展：蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)、毒物蛋白質(zhì)組學(xué)、營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學(xué)及各種計劃,對其他相關(guān)學(xué)科的影響,,1.向其他學(xué)科滲透2.形成了許多新興的邊緣學(xué)科 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)方面：腫瘤分子生物學(xué)、免疫分子生

8、 物學(xué)、神經(jīng)分子生物學(xué)等 預(yù)防醫(yī)學(xué)方面：分子營養(yǎng)學(xué)、分子毒理學(xué)、分 子流行病學(xué)、遺傳流行病學(xué)、人 類基因組流行病學(xué)、 公共衛(wèi)生 遺傳學(xué),,在預(yù)防醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及發(fā)展方向,1.慢性病的研究 慢性病的發(fā)病原因絕大多數(shù)是基因與外界環(huán)境

9、因素相互作用的結(jié)果。2.環(huán)境因素對人類遺傳物質(zhì)損傷的研究及“三致”毒性的研究：生物標志物的研究和評價方法的建立3.環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。,4.遺傳病的產(chǎn)前診斷（基因型預(yù)防）及早期診斷（表型預(yù)防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.對環(huán)境因素敏感基因及易感人群的研究環(huán)境基因組計劃（環(huán)境基因組學(xué)） （1）環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)基因 （2）篩選多態(tài)性及易感性 （3）根據(jù)易感性制定不同的干預(yù)計劃,一、分子生物學(xué)一些重要的理

10、論知識,1.分子生物學(xué)發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學(xué)之父”G.Mendel根據(jù)豌豆雜交試驗結(jié)果，創(chuàng)立了遺傳因子學(xué)說，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年W.Sutton提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，W.Johannsen將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（gene）。,（4）1910年，現(xiàn)代實驗遺傳學(xué)奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的

11、連鎖律和交換律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分離出細菌 DNA，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。（6）1950年，Astbury在一次演講中，首次使用了 “分子生物學(xué)” 術(shù)語。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的機制。,（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年 破譯了64個遺傳密碼。

12、 提出了遺傳信息由DNA → RNA→蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈佛大學(xué)成功分離出第一個基因。（10）1970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（11）1961年，F(xiàn).Jacob和J.Monod提出了乳糖操縱子學(xué)說。,（12）自1946年起的20年當(dāng)中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；1968年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性內(nèi)切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技

13、術(shù)問世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技術(shù)（15）1990年，人類基因組計劃。,2.三個重要理論important theory(1)DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、中心法則基本構(gòu)成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤 (A)、鳥嘌呤 (G)、胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進一步盤旋、折疊，形成三級或四級結(jié)構(gòu),RNA與DNA有如下不同點：五碳糖為核糖(

14、不是脫氧核糖)；堿基中有尿嘧啶U(uracil)而沒有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。 DNA存在于細胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中(質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子)。,,DNA(或RNA) 結(jié)構(gòu)給我們的啟示 ①DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保留的是水相、而不是有機相。②核酸是兩性電離，既帶正

15、電荷，又帶負電荷。它的等電點(PI)為2～2.5。在中性溶液中帶負電荷。對核酸進行電泳時，點樣時應(yīng)點在負極；雜交時選擇尼龍膜時，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉),③DNA在細胞中存在部位不同(細胞核、線粒體、質(zhì)粒)，所以應(yīng)注意提取方法的不同 ④由于DNA空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率不同。⑤根據(jù)堿基互補配對原則，可設(shè)計引物和探針雜交。⑥由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA易由于分子內(nèi)氫鏈作用

16、形成二級結(jié)構(gòu)，所以在進行雜交等反應(yīng)時，首先應(yīng)加熱變性，破壞二級結(jié)構(gòu)。,在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈 在特定的復(fù)制起始點 以每條DNA鏈為模板 在DNA聚合酶的催化下 以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補DNA鏈。DNA的復(fù)制雙稱為半保留復(fù)制。,DNA的復(fù)制,DNA 半 保 留 復(fù) 制,DNA在復(fù)制起始點，由解旋酶打開雙鏈，形成復(fù)制叉，合成新鏈的方向為5’-3’端前導(dǎo)鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不連續(xù)的。 先

17、合成RNA引物 再合成不連續(xù)的小片段(岡崎片段，100～1000核苷酸長度) 最后在DNA連接酶作用下，將小片段連接起，形成完整的DNA鏈。,DNA 半 不 連 續(xù) 復(fù) 制,DNA的復(fù)制給了我們一些啟示① PCR技術(shù)的原理：在體外要靠溫度(90℃以上)打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP為前體。PCR與體內(nèi)(細胞內(nèi))DNA復(fù)制的最大差異是溫度。②檢測核分裂指數(shù)：在細胞培養(yǎng)中，加入3H

18、標記的dNTP前體物，被細胞攝取后，參與DNA復(fù)制，復(fù)制速度越快，參入的3H標記的dNTP越多，可用液閃計數(shù)儀檢測放射性強度，據(jù)此判斷。,遺傳信息的傳遞是： DNA→RNA→多肽(蛋白質(zhì))在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白質(zhì)以上就是完整的中心法則理論，亦可稱為基因的表達(expression)。,中心法則,中 心 法 則,,轉(zhuǎn)錄(transcription) 以D

19、NA為模板，合成RNA的過程。 非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。 轉(zhuǎn)錄的過程大致是這樣的： 以DNA一條鏈為模板， 誘導(dǎo)RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點 以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉(zhuǎn)錄)RNA 當(dāng)遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，轉(zhuǎn)錄即停止。,有意義鏈,反義鏈,,,轉(zhuǎn)錄后的初級產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯子連接起來，這樣才能變成成熟的RNA分子還需要在5’-端加一個特殊的核苷

20、酸，7-甲基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽另外，mRNA的，這一過程又叫穿靴， 3’-端還要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸化。同一機體不同的細胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織特異性，使不同的細胞具有不同的功能,由RNA →蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應(yīng)產(chǎn)物是mRNA，而只有mRNA才翻譯成蛋白質(zhì)?；?DNA)上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決定一種特

21、定的氨基酸，共有43=64個密碼子。在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成mRNA上的三聯(lián)密碼子。mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需要加工修飾。,中心法則給了我們一些啟示：,①遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導(dǎo)致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致生理功能改變，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。② mRNA更能準確簡便地反映DNA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因

22、序列的分析，常分析mRNA的序列即可。,③基因的表達有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的表達增強、降低甚至關(guān)閉，從而影響機體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需要檢測mRNA的表達的豐度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。這里需要特別強調(diào)：在檢測mRNA(或蛋白)表達時，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達。,④根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下

23、形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 ⑤根據(jù)mRNA的3’端有poly(A)的特點，在進行反轉(zhuǎn)錄時，就以poly(A)為模板設(shè)計了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據(jù)poly(A)的原理設(shè)計的。⑥根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細胞核、在細胞漿、分泌到血液中。,,,,,（2）基因表達調(diào)控 以乳糖操縱子學(xué)說為例 乳糖操縱子的基本組成元件,,,調(diào)節(jié)基因

24、 結(jié)構(gòu)基因 I P O Ⅰ Ⅱ Ⅲ,,,,,,,,,,,抑制基因(I) ：是阻遏物編碼區(qū)啟動基因(P) ：有cAMP受體蛋白(CRP) 和RNA聚合酶的結(jié)合位點操縱基因(O)：是阻遏物結(jié)合位點,Ⅰ ：β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因Ⅱ：透過酶結(jié)構(gòu)基因Ⅲ：轉(zhuǎn)乙酰酶的結(jié)構(gòu)基因,調(diào)節(jié)方式 當(dāng)乳糖↑時,cAMP含量增高↑→ cAMP與CAP (分解產(chǎn)物激活劑蛋白)結(jié)合成

25、CRP該復(fù)合物與啟動基因上對應(yīng)的位點結(jié)合后使DNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNA聚合酶則容易與啟動基因緊密結(jié)合；若此時操縱基因上無阻遏物，則基因被打開RNA聚合酶從DNA的5’端開始滑動，即開始轉(zhuǎn)錄，并合成了3種酶。,當(dāng)葡萄糖↑→cAMP↓→CRP↓RNA聚合酶則不能與啟動基因結(jié)合，也就不能轉(zhuǎn)錄和合成3種酶。抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成阻礙蛋白，并與操縱基因結(jié)合,阻止RNA聚合酶滑動而抑制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱為負調(diào)節(jié)如果阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合(

26、此處為乳糖) 。則這個復(fù)合物不能與操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進行。,操縱子學(xué)說擴大了基因的概念。即結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因發(fā)揮正、負調(diào)節(jié)受細胞內(nèi)外環(huán)境因素的影響。形成了基因調(diào)控和表達的概念?；虮磉_調(diào)控理論，不僅有助于理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，而且對基因工程的建立是至關(guān)重要。,（3）DNA重組(基因工程)基因工程的兩個重要工具：一是內(nèi)切酶，能特異地識別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當(dāng)中將DNA切開。二是載體，如質(zhì)粒、噬菌體、病毒

27、。載體的共同特點： 環(huán)狀DNA；都能專一感染某一類細胞；具有某種選擇性標記；都具有一些內(nèi)切酶位點；都能隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，隨著細胞分裂而擴增。,,基因工程的基本程序： ①取得所需要的目的基因； ②將目的基因同載體連接； ③再將這個重組環(huán)狀DNA引入受體細胞(或稱寄主細胞)； ④使目的基因得以表達，即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。,第二節(jié) 核酸的提取技術(shù)extractive technique of nucleic a

28、cid,,,1. 結(jié)合狀態(tài) 2.形態(tài)：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈 3.分布： DNA分布在細胞核和細胞； RNA 分布在細胞質(zhì)、細胞核和細胞器,（一）核酸在細胞中的存在狀態(tài)和分布,（二）核酸分離提取的原則、要求 1.原則：(1)應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； (2)排除其它分子的污染，純度要高。 2.對于核酸純度的要求： (1)對于核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑

29、制作用 的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； (2)其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子 污染應(yīng)降低到最低程度； (3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時， 應(yīng)去除RNA，反之亦然。,3.注意事項 (1)盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞(2)減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的 破壞，操作多在pH4～

30、10條件下進行。,(3)減少物理因素對核酸的降解。物理因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為0～4℃。(4)避免生物因素對核酸的降解。細胞內(nèi)外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過程中，應(yīng)注意采用核酸酶抑制劑和破壞方法。,(三)DNA的提取、純化 真核細胞染色體DNA的制備(提取、純化) 根據(jù)不同的實驗要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽

31、提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在基本原理及大致步驟上是基本相同的。而且酚抽提法比較經(jīng)典常用，下面就以此方法為例進行介紹。,酚抽提法 酚抽提法的基本原理：用SDS和蛋白酶K破壞和消化細胞用酚去除水相中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過鹽和乙醇沉淀獲得DNA。,試劑： 1 磷酸鹽緩沖液PBS 2 DNA抽提緩沖液： 10mmol/L Tris.cl (緩沖溶液的pH值，pH8.0)。 0.

32、1mol/L EDTA(金屬離子絡(luò)合劑，可抑制DNA聚合酶活性)。 20μg/ml 胰RNA酶(破壞降解RNA) 0.5% SDS(表面活性劑，破壞細胞) 。 蛋白酶K (消化細胞、破壞細胞),3．20mg/ml蛋白酶K，消化細胞，破壞細胞4．酚（用0.5 mol/L Tris·Cl，pH 8.0飽和），主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等5．10 mol/L NH4Ac，其作用是沉淀DNA6．乙醇，其作用是沉淀DN

33、A7．TE（Tris和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液8．透析液： 50 mmol/L Tris·Cl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0,樣品前處理 (1)生物組織：新鮮的生物組織，先用剪切刀清除組織中筋膜等結(jié)締組織，吸干血液。若不能馬上進行DNA提取，可將生物組織貯存于液氮中或-70℃冰箱中。a.取1～3g左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液

34、氮中使組織結(jié)凍，取出后用木錘將其敲碎。b.將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，加入少許液氮，用研杵碾磨。需反復(fù)添加液氮。,C.在離心管中加入10ml DNA抽提液，用玻璃棒邊攪動邊加入組織粉末，然后37℃保溫1小時。(先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNA的機率，37℃保溫1小時，一方面有利于SDS破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度達到37℃，為下一步反應(yīng)準備適宜條件)。,(2)培養(yǎng)的細胞

35、a.收集細胞，懸浮培養(yǎng)(生長)的細胞；可以直接經(jīng)1500g離心(4℃,10分鐘)，以收集細胞；貼壁生長的細胞，用胰酶消化后再離心收集。細胞數(shù)應(yīng)在5×107左右。 b.漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用冰預(yù)冷的PBS液或生理鹽水，漂洗1次再離心，棄上清收集細胞。可重復(fù)漂洗1-2次(目的去除培養(yǎng)液成分和細胞分泌的蛋白) c.保溫，再用10ml DNA抽提液將細胞沉淀懸浮，并在37℃保溫1小時。,(1)消化 向上述預(yù)處理好的樣品

36、溶液中(樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時)，加入20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度為100μg/ml，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀(細胞破裂，蛋白、核酸釋放)。將反應(yīng)液在50℃水浴上，保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應(yīng)不時輕輕搖勻反應(yīng)液。,DNA提取步驟,(2)加酚混勻 將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等容積已飽和的酚溶液，輕輕地上下轉(zhuǎn)動離心管，混勻兩相，反復(fù)該動作10min，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。若沒有達到這種

37、效果，可用多角度振蕩器溫和地混勻1小時(3)離心 室溫5000g，離心15min，使兩相分開(水相在上層，酚相在下層)，(DNA在水相，因水溶性，帶負電荷)。(4)取上層水相用酚重復(fù)抽提兩次，取上層水相時，應(yīng)用大口徑(0.3cm)吸管，因水相粘稠,(5)又分兩種情況 a.透析處理：為提取大分子量DNA(200Kb以上)，在第3次酚抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中，并放入4℃透析液中。每次透析液1升，換4次透析液，直至透析物OD2

38、70小于0.05，才算透析完畢。b.沉淀處理，對于100～150Kb大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的離心管中，加入0.2倍容積的10mol/L乙酸銨和2倍容積95%乙醇。室溫下輕輕搖動，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個前端為鉤狀的玻璃棒(挑)出DNA纖維，立即放入70%乙醇中漂洗2次。室溫5000g，離心5min，棄上清。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TE(pH8.0)溶解D

39、NA 12～24h 。,,(6)測定樣品在260nm和280nm的OD值，計算DNA含量和A260/A280比值。 260nm處，是核酸的最大吸收波長，在280nm處是蛋白質(zhì)最大吸收波長。 在260nm紫外線下，1OD的光密度值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA或RNA為40μg/ml。因此根據(jù)核酸的OD值，計算核酸樣品的濃度或含量。,根據(jù)A260/A280比值，可判斷所提取核酸(DNA)的純度。DNA純度比較理想

40、的比值是1.8，RNA比值是2.0。若DNA比值高于1.8，說明有RNA的污染，低于1.8或1.75，則認為是蛋白質(zhì)或酚污染。RNA比值小于2.0，則認為也是蛋白質(zhì)或酚的污染。DNA樣品純度不符合要求(尤其是A260/A280比值小于1.8時) 可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提2-3次， 用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。 最后用鹽和乙醇沉淀，用TE溶解。,本方法需要說明的幾點：(1) 5×107細胞提取產(chǎn)量為200μ

41、g左右。(2)對于上層水相比較粘稠，吸取上層水相時，會牽動兩相之間的蛋白質(zhì)沉淀層。此時可用吸管插到管底吸取酚相(采用負壓)，至蛋白質(zhì)層時，停止。并離心(5000g,20分鐘)，沉淀蛋白質(zhì)，吸取上清液。(3)由于0.5% SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應(yīng)加大該酶用量，一般為20 μg/ml(4)所用酚，應(yīng)重蒸酚，并用水飽和。,（四）RNA的分離與純化,1. 創(chuàng)造一個無RNA酶(RNase)的環(huán)境RNA酶在環(huán)境中無處不在

42、：空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在RNase 。RNase非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活。 RNase活性不需要輔助因子，因此EDTA對此酶無抑制作用。,(1)去除外源性RNase的污染①空氣中的細菌、霉菌等微生物都含有RNase，所以整個操作過程應(yīng)在比較清潔的環(huán)境中進行。因此有必要對操作場所的空氣進行消毒。②操作者操作應(yīng)戴口罩和手套、帶帽子。③玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0

43、.1%DEPC(二乙基焦碳酸鹽)浸泡處理(37℃，2h)，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4h以上或200℃干烤過夜。,④塑料器材最好使用滅菌的一次性塑料用品。Eppendorf管，微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓消毒。⑤所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05-0.1%，室溫過夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPC。⑥RNA提取所用的酚，應(yīng)單獨配制和使用。配制飽和酚鹽溶液時，使用的水應(yīng)預(yù)先以DEPC處理

44、且高壓消毒，酚飽和以后，加入8-羥基喹啉至0.1%。8-羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。,DEPC的分子式為C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強的抑制作用。作用機制是通過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。DEPC又能與RNA或單鏈DNA反應(yīng)，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100-1000倍。使用DEPC的一個原則是，

45、在達到使用目的后，一般要高溫處理以便破壞除掉DEPC，使DEPC不與RNA接觸。,DEPC可與Tris發(fā)生反應(yīng)，分解成CO2和乙醇，使pH值下降（所以要去除）配制Tris溶液時，先將所用水用DEPC處理高壓消毒配完Tris溶液后，再經(jīng)高壓消毒。DEPC與肝素聯(lián)合使用，增強使用效果。DEPC應(yīng)在4℃或液氮中保存，以防降解。,(2)抑制內(nèi)源性RNase的活性。細胞裂碎的同時，RNase釋放出來。原則上應(yīng)盡早去除細胞內(nèi)蛋白，加入R

46、Nase抑制劑，力爭在提取的起始階段對RNase活力進行有效地抑制。不同組織細胞中內(nèi)源性RNase的數(shù)量不同，胰腺、脾組織細胞中RNase的含量極為豐富，在對這些組織提取RNA時，更要使用強有力的RNase抑制劑。,抑制劑可分為以下幾類： ①低特異性RNase抑制劑，如皂土、復(fù)合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現(xiàn)已不大使用。②去除蛋白質(zhì)物質(zhì) 蛋白質(zhì)變性劑，蛋白K、陰離子去污劑，常與RNA酶抑制劑聯(lián)合使用，以加強對RNase的

47、抑制作用。凡能破壞蛋白質(zhì)的物質(zhì)，對RNase均有一定作用，因為酶本身就是蛋白質(zhì)。,a.酚、氯仿 這類有機溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚(但不能破壞核酸)，而且對蛋白質(zhì)有變性作用。因而對酶(RNase)有抑制作用。酚不能完全抑制RNase活性，但酚一般都加入了8－羥基喹啉(一種抗氧化劑，一種指示劑)，因而加強了對RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因此酚與氯仿常聯(lián)合使用。 蛋白酶K也能抑制RNase活性。有一種情況挺特殊，即該

48、酶在1－2％的SDS存在下，其活性反而會增加。,b.去污劑 包括SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團結(jié)合，在高濃度KCl存在下，形成SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀。 c.解偶劑（胍類）鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，從而使細胞結(jié)構(gòu)降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱解偶劑。,③ RNase的特異抑

49、制劑a. RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價鍵的形式結(jié)合，從而抑制RNase活性， RNasin最好不與蛋白質(zhì)變性劑一同使用，因變性劑亦可破壞RNasin ，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強RNasin的使用效果。b.氧釩核糖核苷復(fù)合物，這也是一種RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNase的活性。 為達到完全、徹底抑制RNase活性的目的，常聯(lián)合使用，而且有些抑制劑

50、(去除蛋白質(zhì)物質(zhì))一般有4種作用；破壞細胞膜，使核酸與蛋白質(zhì)分離，沉淀蛋白質(zhì)、抑制RNase活性。因此幾乎包括了RNA提取、分離、純化的所有目的。,2.RNA的分離、提取方法步驟： (1)創(chuàng)造一個無RNase環(huán)境； (2)組織或細胞的勻漿，同時得加入RNase抑制劑 (3)裂解細胞； (4)去除蛋白、DNA等大分子物質(zhì)； (5)沉淀RNA； (6)漂洗； (7)溶解RNA。,酚：使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋

51、 白質(zhì)，抑制RNase活性。異硫氰酸胍：破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強的RNase抑制作用。這是一個關(guān)鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗步驟變得簡單。,Trizol試劑盒所提供的試劑：,自己需要配制的試劑,氯仿：蛋白質(zhì)變性作用，增強對RNase抑制作用。異丙醇：沉淀RNA。75％乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機溶劑等雜質(zhì)。無RNase水或0.5%SDS溶液(后者較好)(必須用DEPC處

52、理)。,①勻漿化 a.組織：取50-100mg組織放在勻漿管中，加1ml Trizol試劑，然后進行勻漿，此時裂解細胞和RNase抑制同時進行。 b.貼壁生長細胞：倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶(皿)中加入Trizol試劑(按10cm2加1ml Trizol試劑計算加入量)。 c.懸浮生長細胞：離心收集細胞，然后加入Trizol試劑（按5～10×106或1×107細菌加入1ml比例計算加入量)。

53、,操作步驟,②兩相分離 將勻漿化的樣品在15℃～30℃環(huán)境中放置5min，以便核酸蛋白復(fù)合物充分解聚。（加Trizol試劑之前，樣品一定要保持低溫，防止RNase 發(fā)揮作用，在研磨過程中可加液氮）然后按每1ml Trizol試劑加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿。蓋緊試管蓋，用手劇烈振蕩15秒，之后在15?～30℃條件保溫2～3min。離心：12000g離心15min，離心時溫度要控制在2℃～8℃。（12000g離心是一個關(guān)鍵步驟，也

54、是該方法獨到之處，可將蛋白質(zhì)，DNA等大分子沉淀)。離心之后，就會形成三相：下層是紅色的酚和氯仿（含有蛋白質(zhì)和DNA）；中間層是白色的DNA和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相，RNA就在此層，水相大約占總體積的60％,③ RNA沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到一個新的試管中，并加入異丙醇混勻，加入量按每ml Trizol試劑加0.5ml異丙醇計。在15?～30℃條件下，保溫10min。然后在2～8℃條件下，12000g離心10min，此時就會在管底或底

55、部邊上出現(xiàn)RNA沉淀，離心之前，RNA沉淀通?？床灰?，離心之后常?？煽匆娔z樣沉淀。 ④RNA漂洗 移去上清液，加入75％乙醇至少1ml，渦旋振動幾次，然后以7500g離心5min(溫度2?～8℃)，又可形成RNA沉淀，并移去上清液。,⑤重新溶解RNA 將RNA沉淀在空氣中放量5～10min，以便揮發(fā)掉殘留的乙醇。注意干燥時間不宜太長，以防RNA完全干燥。完全干燥的RNA很難溶解。最后用無RNase水或0.5％SD

56、S溶液溶解RNA，并用移液管吹打幾次，并在55℃ ～60℃保溫10min，以便使RNA完全溶解。,⑥判定純度和計算含量，用紫外分光光度計測量溶液的吸光度質(zhì)（A）。A260/280在1.6～1.8之間表明比較純凈，符合實驗要求。1OD值＝40μg RNA,據(jù)此再計算RNA含量。,一般來講，該方法可從1mg組織中提取的RNA含量分別為：肝和脾為6～10μg ；腎3～4μg ，肌肉和腦為1～5μg ，胎盤1～4μg 。對培養(yǎng)的細胞來講，

57、1×106個上皮細胞中可提取8～15μg ，成纖維細胞5～7μg 。 用Trizol試劑盒法提取的RNA，基本上可滿足所有實驗的需要，如Northern blot，斑點雜交，mRNA分離、體外翻譯，分子克隆等。 該方法操作簡便，提取的RNA完整，整個提取過程僅需1h，故現(xiàn)在廣泛使用。,第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù),,1.探針的概念：在化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(Probe)，是指能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的

58、分子，并可被特殊的方法所探知(檢測到)。所謂核酸分子探針則是指特定的已知核酸片段，并帶有標記物，能與互補核酸序列退火雜交，因此可以用于待測核酸樣品中特定基因順序的探測（可定性、定量）。,(一)探針的概念、種類及其選擇、探針的標記,2.探針的種類、選擇及特點,種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探 針、寡核苷酸探針選擇：寡核苷酸探針 寡核苷酸探針是指人工合成的短鏈核苷

59、 酸片段，并帶有標記物特點：人為控制，雜交時間短，特異性高，可 以用于點突變檢測；缺點是靈敏度低,設(shè)計寡核苷酸探針應(yīng)遵循的（以下）幾個原則： ①探針長度：一般要求10～50bP。過短則特異性降低，過長，則合成困難、雜交時間延長，亦會出現(xiàn)非特異性雜交。應(yīng)不短不長。 （一般20bp） ② G：C堿基對含量應(yīng)占40～60％；過少，則不易雜交，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過多，則會產(chǎn)生非特異性雜交，

60、應(yīng)不多也不少。（一般AT、GC各占50%） ③探針內(nèi)部的互補堿基對不應(yīng)大于4bP，否則會形成探針內(nèi)部的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。 ④同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)不應(yīng)超過4次。 ⑤探針設(shè)計完后，最好利用基因庫軟件進行分析，并與已知的各種基因序列進行同源性比較，如果該探針與非目的基因序列有70％以上的同源性，或連續(xù)有8個以上的堿基序列相同，則應(yīng)重新設(shè)計探針序列。,3.探針的標記物與標記 標記物： 放射性核素：32P、3

61、5S、3H、125I、131I 非放射性標記物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學(xué)發(fā)光物,根據(jù)待測核酸分子存在的部位不同，可分固相雜交（膜上印跡雜交、細胞原位雜交）和液相雜交。其中膜上印跡雜交應(yīng)用廣泛。 膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。,（二）雜交,首先用凝膠電泳方法將待測核酸片段分離，然后用印跡技

62、術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上（轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變）。 再用標記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交。 最后洗去未雜交的游離的探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記的探針的位置及量的多少。 概括起來，雜交主要包括三個步驟：印跡、雜交和檢測。,膜上印跡雜交的基本操作流程,1.印跡技術(shù),印跡技術(shù)是指將待測核酸分子轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上的方法

63、。 印跡技術(shù)主要包括兩個關(guān)鍵因素：選擇良好的固相支持物；有效的轉(zhuǎn)移方法。,⑴ 固相支持物的選擇,①具有良好的機械性能，如柔軟性好，韌性強，以便操作 時不易損壞；②具有較強的結(jié)合核酸分子的能力；③與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)；④與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操 作過程，而不會脫落或脫落極少；⑤非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時也易被洗脫掉。,硝酸纖維素濾膜尼龍膜化學(xué)活化膜濾

64、紙其中前2種更為常用,目前常用的固相支持物,硝酸纖維素濾膜,具有較強的吸附結(jié)合單鏈DNA和RNA的能力，特別是在高鹽濃度，其結(jié)合力可達80μg/cm2～100μg/cm2。這種結(jié)合主要靠疏水作用。非特異性吸附核酸（探針）能力較弱，因此雜交信號本底值較低。 常用于Southern、Northern斑點印跡及克隆篩選等實驗。,缺點：①與核酸的結(jié)合力較弱（因為是靠疏水作用），在雜交及洗脫的進程中，核酸會慢慢脫落，特別是在高溫情況下，更容易

65、脫落，從而使雜交率下降。另外硝酸纖維素膜對于小分子量DNA片段結(jié)合力更弱，因此不太適合小分子DNA片段的雜交。②硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆，特別是經(jīng)烘烤后更易破損，因此操作不方便，須特別小心。另外值得注意的是，硝酸纖維素膜與核酸的結(jié)合，有賴于高鹽濃度，而高鹽溶液又不適合于電轉(zhuǎn)印跡法（電流大，產(chǎn)熱）。,尼龍膜,尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型。有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理，叫普通尼龍膜。有些則是經(jīng)過了正電荷基團的修飾，又叫特殊

66、尼龍膜。特殊尼龍膜帶有正電荷，核酸帶有負電荷，因此二者可靠靜電吸引牢固結(jié)合。因此尼龍膜對核酸的結(jié)合力要比硝酸纖維素膜強好多倍。特別是經(jīng)短波紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯(lián)，從而使結(jié)合更加牢固。因此特別適用于小分子核酸片段的雜交。另外堿處理也可使核酸牢固地結(jié)合在尼龍膜上，因此使DNA的變性、吸附和固定可一步完成，特別適用于菌落原位印跡法。,尼龍膜質(zhì)地堅韌，不易損壞，操作方便，可 進行多次重復(fù)雜交。另外，在

67、低離子強度條件下，也可與核酸牢固結(jié)合，因此適用于電轉(zhuǎn)印跡法。 缺點：由于結(jié)合力強，非特異性吸附較多，雜交信號本底較高，應(yīng)注意封閉。,⑵ 印跡方法,轉(zhuǎn)移方法不同，可分為①斑點或狹縫印跡，即直接將核酸樣品點樣于固相支持物上；②虹吸印跡法，利用毛細管虹吸作用，由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動核酸分子轉(zhuǎn)移到固相支持物上；③電轉(zhuǎn)印跡法，即利用電場力的作用將核酸帶到固相支持物上；④真空轉(zhuǎn)移法，即利用真空抽濾作用，將核酸分子帶到固相支持物上。,

68、根據(jù)要轉(zhuǎn)印核酸品種的不同，又可分為 Southern印跡法：是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 Northern印跡法：是指RNA的印跡過程。,步驟： a.DNA分子經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切。酶切變成合適長度的DNA片段（根據(jù)實驗?zāi)康亩ǎ蛔儥z測則短，定性定量則長）。一般理想的是0.5～10Kb，因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率。 b.在瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離DNA片段，經(jīng)