原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)匯總

1、原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),指導(dǎo)教師：費(fèi)曉方,2005年5月,掌握無(wú)菌操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。了解倒置顯微鏡的使用。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?實(shí)驗(yàn)原理：,原代細(xì)胞培養(yǎng)是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,動(dòng)物的選

2、擇： 選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10－13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。 每組小鼠胚胎1個(gè),實(shí)驗(yàn)材料：,每組的超凈臺(tái)中有以下物品：1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶2. 100ml滅菌燒杯2個(gè)；3、50ml離心筒2個(gè)4、

3、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)4、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個(gè)；無(wú)菌玻璃攪拌棒1個(gè)5、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊；6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；7、酒精燈1臺(tái)；,試驗(yàn)操作步驟：,1)胚胎的分離。適用哺乳動(dòng)物(倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠) a．采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。 b．立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用70％乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。 c．用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。 d．用另一無(wú)菌

4、的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。 e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌PBS的100ml燒杯中。 f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。,2)將1－2個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用PBS漂洗。3)在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml 的無(wú)菌離心筒中, 加入40ml 0.25％的無(wú)菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動(dòng) 。

5、4)在溫暖的環(huán)境中或置于37 °C培養(yǎng)箱中輕輕搖動(dòng)15分鐘。5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。,6)加人新鮮胰蛋白酶溶液(見(jiàn)前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來(lái)的50ml離心筒中，重復(fù)步驟4和5。7)離心混合的細(xì)胞懸液，1200r／rain，5分鐘，棄上清。8)用新鮮的無(wú)菌PBS重懸沉

6、淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。9)用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、鏈霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再懸沉淀，并使終體積為20ml。11)讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。可采用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。12)為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入0.2ml細(xì)胞懸液于1.8ml 1％醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。13)按每細(xì)胞