實驗七+人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)

1、1實驗五實驗五人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)一、實驗原理一、實驗原理外周血液中的小淋巴細胞，幾乎都處在G1期(或Go期)，一般情況下是不再分裂的，在培養(yǎng)液中加入植物凝血素(PAH)時，這種小淋巴細胞受刺激轉化成為淋巴母細胞，隨后進入有絲分裂。這樣經過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的有絲分裂細胞。本方法已為臨床醫(yī)學、病毒學，藥理學、遺傳毒理學等方面廣泛應用。二、實驗目的二、實驗目的掌握人體微量血液體外培養(yǎng)

2、、制備染色體標本的方法。三、實驗材料三、實驗材料人的外周血。四、實驗器具和藥品四、實驗器具和藥品1用具用具:2毫升滅菌注射器，離心管，吸管，試管架，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶，酒精燈，燒杯，載玻片，切片盒，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，顯微鏡。2器皿的清洗和消毒器皿的清洗和消毒玻璃器皿在使用前，均應用肥皂水洗刷，清水沖凈，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水沖洗，烘干待消毒。將已洗凈、烘干的玻璃器皿裝入鋁盒或用紙包裝，放入干燥消毒箱內；150℃1

3、h。隔離衣、口罩。橡皮塞，注射用針筒等則用高溫高壓消毒(15磅15min)。3藥品藥品(1)RPMI“1640”培養(yǎng)基：稱取“1640”粉末10.5克，用1000ml的雙蒸水溶解，如溶液出現混濁或難以溶解時，可用干冰或CO2氣體處理，如pH值降至6.0時，則可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO，1.0－1.2g，以干冰或CO2氣體校正pH至7.0－7.2。立即以5號或6號細菌漏斗過濾滅菌，分裝待用。(2)肝素：作為抗凝劑使用。稱

4、取該粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為每ml500U。高壓消毒8磅15min。(3)秋水仙素：作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細胞質的粘度；抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停留在中期。稱取秋水仙素4mg，用100ml生理鹽水溶解，用6號細菌漏斗過濾，然后放入冰箱4℃保存。使用時用1ml注射器吸取該溶液0。05－0.1ml加入5ml的培養(yǎng)物中，其最終濃度為0.4—0.8ug／ml。(4)植物凝血

5、素(PHA)：是淋巴細胞有絲分裂刺激劑。提取PHA的方法有兩種。一種比較簡單，直接用四季豆的浸出液；另一種較復雜，最后制品為粉末。如用之得當，二種方法均可獲得良好的效果。鹽水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它顏色如紅斑色、黑色.黃色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗凈可能粘附在種子外面的化學藥物。先在水中浸過夜(4℃)，次日倒去水分，將豆子放入組織攪碎器內，加30ml生理鹽水，開動攪碎器使之成為粘糊狀，向攪碎器再加70ml生理鹽水，

6、混合均勻。置冰箱24h。然后以3000轉／min離心15min，取上清液，用生理鹽水稀釋10倍，5號除菌濾斗過3中置37℃溫箱內處理20min，使紅細胞破碎，白細胞膨脹。6離心離心:以每1000rpmmin，離心5min，棄去上清液，收集白細胞。7固定：固定：固定液為甲醇：冰醋酸：3：1。每只離心管中，加入固定液2－4ml，片刻后用滴管輕輕沖打成細胞懸液，在室溫中固定15min后，離心，吸棄上清液，留下白細胞。8再固定：再固定：加入固定

7、液2ml，用吸管輕輕打散，室溫下繼續(xù)固定15min(過夜也可以)。9再離心：再離心：除去上清液，留下白細胞制片。10制片制片:向上述離心管中滴入固定液0.5毫升，用滴管小心沖打成懸液，從冰箱的冰格中或冰水中取出載玻片，每片滴加懸液1—3滴，用嘴輕輕吹散，用電吹風吹干，或在酒精燈火焰上微微烤干。11染色：染色：用磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋后的姬姆薩染色液染色20min，然后倒去染液，用蒸餾水輕輕沖洗。12鏡檢：鏡檢：待稍午后，在顯維鏡下