亞洲璃眼蜱HBP基因的克隆表達(dá)及其活性研究.pdf

1、蜱是家畜體表的一種吸血性外寄生蟲，作為傳播媒介，可傳播多種由病毒、細(xì)菌、螺旋體、立克次氏體及血原蟲等疾病，不僅給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時還給人類公共衛(wèi)生帶來極大的危害。我國目前發(fā)現(xiàn)的蜱種有100多種，其中，亞洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum）是我國的主要優(yōu)勢蜱種，主要傳播環(huán)形泰勒蟲病、巴貝斯蟲病和新疆出血熱。當(dāng)今世界，免疫預(yù)防被認(rèn)為是最有潛力的防治策略，而獲得相應(yīng)的靶抗原是免疫預(yù)防的前提條件。組胺結(jié)合蛋白HBP（H

2、istamine binding protein，HBP）是蜱體內(nèi)為抑制宿主的免疫應(yīng)答而合成并分泌的一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，在蜱吸血的過程中它具有與宿主所釋放的組胺結(jié)合的能力，從而識別自己宿主的免疫應(yīng)答，以保證其持續(xù)長時間的吸血。蜱體內(nèi)HBP的重要作用使之成為抗蜱及蜱傳病的候選抗原分子之一。本課題以亞洲璃眼蜱為研究對象，通過從亞洲璃眼蜱體內(nèi)克隆HBP基因，并在體外表達(dá)，分析其功能，為蜱及蜱傳疾病的免疫預(yù)防做一些探索性工作。
　　 首先

3、，以亞洲璃眼蜱唾液腺差異表達(dá)基因文庫中的可表達(dá)序列標(biāo)簽（Express Sequence Tag，EST）序列為基礎(chǔ)，設(shè)計基因特異性引物3’-GSP和3’-Nested-GSP用于目的基因3’端的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆到pGEM-T easy載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并對其測序。根據(jù)測序結(jié)果和已知的EST序列，設(shè)計基因特異性引物5’-GSP1、5’-GSP2和5’-Nested-GSP用于目的基因5’端擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆

4、到pGEM-T easy載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并對其測序。根據(jù)3’端、5’端測序結(jié)果和已知的EST序列，拼接出目的基因的全長并設(shè)計基因特異性引物F-Primer和R-Primer用于擴(kuò)增全長基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆到pGEM-T easy載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并對其測序，結(jié)果從亞洲璃眼蜱體內(nèi)克隆出一個HBP基因的全長序列。基因全長為902bp，編碼227個氨基酸，預(yù)測分子量為25.9kDa（包括信號肽），經(jīng)Blast同源性分

5、析比較，該基因預(yù)測氨基酸與已報道的其它硬蜱組胺結(jié)合蛋白高度同源，故命名為亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白（Hyalomma asiaticum Histamine binding protein，HaHBP）。結(jié)構(gòu)上，HaHBP具有組胺結(jié)合蛋白二級結(jié)構(gòu)的典型特征，即含有β桶結(jié)構(gòu)，這是組胺結(jié)合的部位，構(gòu)成這種二級結(jié)構(gòu)是由兩個二硫鍵和僅有的四個或五個色氨酸殘基（W）部分決定。HaHBP編碼的氨基酸序列與已鑒定的組胺結(jié)合蛋白在相當(dāng)或相近的位置均有相同或

6、相近的半胱氨酸（C）與色氨酸殘基（W），這與組胺結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特點相吻合。綜合同源性、結(jié)構(gòu)特征、分子量、信號肽、基因表達(dá)特點等生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步預(yù)測HaHBP為一個編碼亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白的一個基因。
　　 其次，利用RT-PCR方法對HaHBP基因在亞洲璃眼蜱體內(nèi)分布情況進(jìn)行分析，別提取亞洲璃眼蜱的各個發(fā)育階段包括卵、幼蜱、若蜱、未吸血成蜱、半飽血成蜱和不同解剖部位包括殼、唾液腺和腸的總RNA，取相同量的總RNA進(jìn)行R

7、T-PCR分析，結(jié)果表明，該基因的表達(dá)具有性別特異性，在蜱的各個發(fā)育階段僅吸血的雌蜱表達(dá)；且HaHBP基因在亞洲璃眼蜱半飽血雌蜱的唾液腺、殼及中腸這三個器官中均高效表達(dá)。
　　 再次，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果表明HaHBP可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，應(yīng)用GST純化系統(tǒng)，可獲得較純的目的蛋白，Western-blot結(jié)果表明原核表達(dá)的融合蛋白具有很好的免疫原性。
　　

8、 最后，以純化得到的融合蛋白GST-HaHBP（GST蛋白作陰性對照）作為抗原包被于ELISA酶標(biāo)板4℃過夜，洗滌后，加入Histamine-HRP酶結(jié)合物37℃反應(yīng)2h，充分洗滌后，加入K-Blue底物顯色10min后，加入終止液5min，酶標(biāo)儀測定OD值。首次證明了HaHBP具有結(jié)合組胺的活性。
　　 綜上所述，本研究成功地克隆到亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白基因；經(jīng)原核表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性，為抗亞洲璃眼蜱疫苗的研制提