蘿卜硫素抗腫瘤活性研究及其關(guān)鍵酶myrosinase基因的克隆表達(dá).pdf

1、蘿卜硫素（1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋⊿FN）是迄今為止蔬菜中所發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最好的天然活性物之一，美國(guó)、日本等國(guó)家從20世紀(jì)50年代就開始研究SFN的性質(zhì)、制備方法、腫瘤抑制機(jī)制及生理功能等，由于其具有多種抑瘤機(jī)制且具有分子量小、治療指數(shù)好等優(yōu)點(diǎn)，SFN現(xiàn)已成為重點(diǎn)研究的抗腫瘤藥候選藥物。我國(guó)關(guān)于SFN的研究較少，關(guān)于其抑瘤活性的研究幾無報(bào)道。本論文利用MTT法、熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等方法研究了SFN對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞A17

2、2、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460、肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)的影響。對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較低濃度的蘿卜硫素能夠誘導(dǎo)A172發(fā)生凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期，并主要以后者為主。而蘿卜硫素對(duì)H460增殖抑制其所需濃度較高，并且主要是通過誘導(dǎo)凋亡通路來實(shí)現(xiàn)?？梢?，SFN對(duì)于不同瘤細(xì)胞株其增殖抑制機(jī)制不同。此外，SFN對(duì)A549和HepG2也有增殖抑制作用，結(jié)合本課題組前期MTT試驗(yàn)結(jié)果：SFN對(duì)瘤細(xì)胞株HeLa、HL

3、-60、CNE、PC3及P388細(xì)胞等均有顯著的體外增殖抑制活性且IC50值較低，說明SFN具有很好的新藥開發(fā)潛力。
　　 硫代葡萄糖苷酶（myrosinase，EC3.2.3.1，簡(jiǎn)稱硫苷酶）又稱黑芥子酶，是黑芥子苷（硫代葡萄糖苷的一種）水解生成SFN過程的關(guān)鍵酶。在生命進(jìn)化歷程中，硫苷酶基因往往以多個(gè)拷貝的形式存在于物種基因組中并在遺傳過程中被各物種保留，最終形成了一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的基因家族。在甘藍(lán)型油菜中，該基因的研究已非常廣

4、泛，而在同為十字花科植物的西蘭花中其研究卻少見報(bào)道。因此，對(duì)西蘭花硫苷酶基因進(jìn)行克隆并對(duì)其異源表達(dá)進(jìn)行研究對(duì)進(jìn)一步研究該植物的防衛(wèi)機(jī)理和硫苷活性水解產(chǎn)物的獲得具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 硫苷酶在十字花科植物中的重要功能對(duì)硫苷酶基因結(jié)構(gòu)保守性的要求與硫苷酶編碼基因的多基因存在及在進(jìn)化中被保留的現(xiàn)象說明硫苷酶編碼基因序列存在相當(dāng)保守的序列模體和變異相當(dāng)活躍的區(qū)域。因此，利用現(xiàn)有基因數(shù)據(jù)庫中不同物種的硫苷酶編碼序列進(jìn)行同

5、源性比較，探詢硫苷酶編碼基因的保守序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增兩蘭花硫苷酶編碼基因保守序列的引物，結(jié)合利用RACE技術(shù)，在西蘭花中獲得硫苷酶基因的全長(zhǎng)序列是可行的。本實(shí)驗(yàn)以西蘭花幼苗為材料，根據(jù)同源序列法PCR擴(kuò)增硫苷酶特異cDNA片段，進(jìn)一步用3’RACE和5’RACE分別擴(kuò)增cDNA3’端序列和5’端序列，經(jīng)序列拼接獲得西蘭花硫苷酶全長(zhǎng)cDNA序列。利用在線蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析，NCBI CDD數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域

6、查找，在SWISS-MODEL進(jìn)行在線蛋白同源模建，MEGA3.1構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。結(jié)果得到一全長(zhǎng)1830bp硫苷酶cDNA，含有一個(gè)1641bp的ORF及31bp的5’端非翻譯區(qū)和158bp的3’端非翻譯區(qū)，命名為BoMyr2（GenBank登錄號(hào)為ELJ004075）。編碼氨基酸序列含有20氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽并含有9個(gè)天冬酰胺N末端糖基化位點(diǎn)，編碼的蛋白分子量（Mw）約為62.2kD，等電點(diǎn)（pI）為8.71；BoMyr2推測(cè)氨基酸序

7、列含有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶結(jié)構(gòu)域，其編碼蛋白與PDB庫中自芥硫苷酶有相似的三維結(jié)構(gòu)，具有明顯的β/α（TIM）桶結(jié)構(gòu)；BoMyr2應(yīng)歸為硫苷酶基因家族的MB亞族。
　　 由于硫苷酶是一類非組織型表達(dá)的蛋白，通常在植物體內(nèi)含量較低，并且由MB亞族基因編碼的硫苷酶在植物體內(nèi)往往與硫苷酶結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，因此，從植物源出發(fā)通過分離純化獲得大量的硫苷酶很難實(shí)現(xiàn)。西蘭花硫昔酶的原核表達(dá)現(xiàn)無資料公開報(bào)道。根據(jù)RACE結(jié)果設(shè)計(jì)引

8、物擴(kuò)增硫苷酶成熟蛋白編碼區(qū)序列，以pGEX-4T-1為載體，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行GST融合蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在90kD左右處有一明顯的蛋白條帶。預(yù)測(cè)的硫苷酶成熟蛋白分子量為60.17kDa，而融合蛋白N端融合標(biāo)簽蛋白分子量約為26kDa，表達(dá)產(chǎn)物與與預(yù)期大小一致。說明硫苷酶成熟蛋白在BL21中融合表達(dá)成功。不同時(shí)間點(diǎn)GST融合蛋白表達(dá)比較發(fā)現(xiàn)，融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)具有累積作用，在誘導(dǎo)4h后，蛋白表達(dá)量己較高，到6小

9、時(shí)達(dá)最大。融合蛋白活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的融合蛋白基本沒有催化底物sinigrin的能力，即融合蛋白缺乏硫苷酶活性，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的凝血酶酶切加工以及蛋白變性、復(fù)性等方面的研究。
　　 蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）中三維結(jié)構(gòu)已闡明的硫苷酶均存在糖基化現(xiàn)象，利用不同模型對(duì)GenBank中已登錄的硫苷酶全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其編碼基因均含有一段典型信號(hào)肽編碼序列，說明硫苷酶蛋白在黑芥子酶細(xì)胞ER膜上合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到黑芥子酶顆粒的過程

10、中發(fā)生了糖基化反應(yīng)。畢赤酵母（Pichia pastoris）具有對(duì)外源蛋白進(jìn)行適度糖基化修飾的作用。因此，進(jìn)一步將西蘭花BoMyr2成熟蛋白編碼序列重組到Pichiapastoris分泌型表達(dá)載體pPIC9K上，得到重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-BoMyr2，經(jīng)Sac I線性化后電轉(zhuǎn)導(dǎo)入Pichia pastoris KM71。菌落PCR以及重組酵母的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，硫苷酶在Pichia pastoris中進(jìn)行分泌表達(dá)，表達(dá)

11、蛋白分子量約為65kDa。酶活測(cè)定顯示，表達(dá)較好的6株菌株（13＃、15＃、5＃、21＃、41＃、29＃、36＃），13＃、15＃重組菌株其發(fā)酵液上清硫苷酶酶活可達(dá)1.7～1.9U/ml，而36＃菌株其活性為O.75U/ml。硫苷酶比活力分析發(fā)現(xiàn)，同樣是13＃、15＃重組菌株比活力較高，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性達(dá)95％，說明發(fā)酵上清的蛋白量可基本反映外源蛋白的表達(dá)情況和硫苷酶活性。
　　 將酶活相對(duì)較高的13＃菌株，進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶

12、發(fā)酵研究。結(jié)果表明，在BMMY培養(yǎng)基中，pH6.0、1.0％甲醇濃度可以獲得較好的表達(dá)水平；0.05％的油酸和0.1％的表面活性劑吐溫20可以少量提高硫苷酶的表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時(shí)后發(fā)酵上清中硫苷酶總酶活較好，適于發(fā)酵液的回收。重組畢赤酵母在合適條件下其發(fā)酵上清酶活可達(dá)到3U/ml左右。
　　 MA基因亞族編碼的自由態(tài)硫苷酶已得到廣泛深入的研究，而關(guān)于MB基因亞族編碼的硫苷酶因在植物體內(nèi)的表達(dá)情況、存在形式等因素其生化特性至今很