花生抗青枯病的分子生物學基礎研究.pdf

1、花生(Arachis hypogaeaL.)是世界上重要的經濟作物和油料作物。由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染花生引起的青枯病(Bacterial Wilt)是影響熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)花生生長的重要細菌性病害；在我國尤以長江流域以及南方地區(qū)較為嚴重。作為一種土傳性病害，花生青枯病目前尚沒有有效的化學防治手段，與其他作物輪作、間套作及利用生物防治等防治效果也非常有限，因此防治花生青枯病的根本手段還

2、是培育抗病品種。但是由于缺少優(yōu)良的抗病基因源、抗性表現受環(huán)境影響較大以及青枯菌菌系分化的復雜性等，都嚴重影響了花生抗病育種進程。由于青枯雷爾氏菌復雜的多態(tài)性、田間鑒定結果的不穩(wěn)定性，岡此尋求快速、簡便、準確而不受時間限制的室內接種鑒定方法則顯得非常重要。目前國內外對花生青枯病的研究不多，控制花生對青枯病抗性的基因種類和數量以及它們的表達調控機制還不清楚，花生抗青枯病的分子生物學研究基礎還比較薄弱。本研究建立了簡便快速的花生青枯病的抗性鑒

3、定方法，構建了受青枯菌誘導的花生根全長cDNA文庫，也構建了攜帶擬南芥抗青枯病基因RRS1的表達載體，為了解花生青枯菌的侵染和花生抗青枯病機理，奠定前期工作基礎。研究結果如下：
　　 1．選取不同的花生青枯菌菌株，采用傷根灌菌液法接種中感品種閩花6號，測定菌株的致病力差異，菌株431致病力較強，是理想的接種菌株。通過比較幾種不同的侵染方法接種花生，觀察了抗感品種的發(fā)病情況，確定了較為理想的抗性鑒定方法。傷根灌菌液法雖然能夠反映品

4、種的抗性，但是由于菌液接種量大、發(fā)病周期較長給實驗帶來了許多不便；葉腋注射法不能反映品種的抗感性，而且操作繁瑣，我們不予采納：剪葉法接種后25d就能反映出品種的抗性，發(fā)病周期短，而且操作性強以及接種量小，是理想方便的接種方法?？傊?，傷根灌菌液法和剪葉法都能說明品種的抗性，剪葉法優(yōu)于傷根灌菌液法。
　　 2．通過傷根灌菌液法接種抗青枯病品種閩花8號，利用SMART技術構建了受青枯菌誘導的花生根處理和對照全長cDNA混合文庫。初級文

5、庫滴度為1.902×106cfu/m1，插入率99％，插入片段大小在500～2500bp之間，平均為1200bp;擴增文庫滴度為9.68×1011cfu/ml。從文庫中隨機挑取24個克隆進行兩端測序，經過生物信息學分析45％的序列為預測蛋白，功能未知，這說明花生基因組學研究相對薄弱。隨機挑取74個克隆進行兩端測序，利用BLAST2GO軟件進行注釋和功能分析。序列經注釋后功能分析將已知功能的EST按照細胞組分、分子功能和參與生物過程分為三

6、大類，在細胞組分一類中，大多數被歸類為線粒體(mitochondrion)和細胞質膜(plasma membrane)兩類；在分子功能的分類中，結合(binding)和催化活性(catalytic activity)居多；在生物過程的分類中，分為代謝過程(metabolic process)和細胞過程(cellular process)的比較多。物種相似性分布分析與水稻、葡萄、擬南芥較為相似，說明花生上仍有大量的待發(fā)掘功能基因。

7、　　 3．根據已經登錄的RRS1-R基因序列設計引物，通過RT-PCR從擬南芥Nd-1中克隆得到4137bp的抗青枯病基因RRS1-R，與GenBank上登錄的原序列同源性達99％，將該基因片斷連入植物表達載體pSC1301，構建帶抗青枯病基因的植物表達載體pSC1301-RRS1，轉化農桿菌EHA105。然后準備對煙草進行了遺傳轉化進而進行功能驗證，后續(xù)工作正在進行中。
　　 本項目還同時開展了花生對青枯病的抗性遺傳和抗性基