表達豬輪狀病毒VP7與NSP4-VP7基因重組干酪乳桿菌的構(gòu)建及免疫學評價.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PRV)屬呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性的腹瀉的主要病原之一，該病毒主要經(jīng)消化道感染。4周齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病率可高達80％，死亡率可達到20%，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的危害和經(jīng)濟損失。近些年的研究表明豬輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4在病毒復(fù)制和致病過程中起著重要的作用，研究此蛋白的生物學功能對于防治此病具有重要意義。
　　 本實驗中利用大腸桿菌系統(tǒng)可溶表達了豬輪狀病毒弱毒株

2、JL94非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4的截短片段112aa-175aa，即eNSP4，并對其第135、136和138位氨基酸進行突變，將突變前后蛋白分別腹腔注射小鼠，以PBS作為空白對照，于不同時間點觀察小鼠腹瀉情況，記錄小鼠體重變化，對比突變前后該蛋白致腹瀉能力的變化，結(jié)果表明突變后的蛋白致腹瀉能力有明顯增強。
　　 在此基礎(chǔ)上，以干酪乳桿菌Lactobacillus casei393作為遞呈抗原的活菌載體，利用豬輪狀病毒主要免疫保護性抗

3、原基因VP7主要中和位點和突變前NSP4為靶基因，定向插入到干酪乳桿菌表面表達和分泌型表達載體pPG-1、pPG-2，構(gòu)建了pPG-1-VP7/L.casei393、pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393和pPG-2-NSP4-VP7/L.casei393重組乳酸桿菌系統(tǒng)。為進一步探索NSP4在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中能否起到免疫佐劑作用，實驗將小鼠分為4組，以PBS作為空白對照組，用重組菌口服免疫小鼠，共免疫3次。免疫后于第1

4、、2、3、5、7、9d采集血清、糞便、外生殖道沖洗液樣品，檢測糞便、外生殖道沖洗液樣品中特異性的sIgA和血清IgG水平，并通過動物實驗測定血清抗體中和突變后NSP4毒性的能力，以評價其免疫效果。
　　 檢測結(jié)果表明，口服免疫重組干酪乳桿菌后在小鼠糞便、外生殖道沖洗液均檢測到了特異性sIgA抗體，在小鼠血清中檢測到了特異性的IgG抗體。小鼠外生殖道和糞便中的sIgA以及血清IgG水平與對照組相比，均差異顯著(P<0.05)。同時

5、免疫組pPG-1-VP7/L.casei393和pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393、pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393和pPG-2-NSP4-VP7/L.casei393在抗體水平高峰也表現(xiàn)出差異，相對于重組干酪乳桿菌pPG-1-VP7/L.casei393組來說，重組干酪乳桿菌pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393可以誘導機體產(chǎn)生較高的血清和黏膜抗體水平，表明突變前NSP4具有免疫佐劑作用。

6、而pPG-2-NSP4-VP7/L.casei393與pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393相比則可以誘導機體產(chǎn)生更高水平的血清和黏膜抗體，表明分泌型表達載體較表面型表達載體呈現(xiàn)出更好的免疫效果。中和實驗結(jié)果顯示，NSP4血清抗體中和腸毒素后在各個時間點小鼠的腹瀉只數(shù)均少于對照組，同時小鼠平均體重增長高于對照組，說明突變前NSP4抗體可以在一定程度上中和腸毒素毒性。
　　 本實驗為輪狀病毒治病機制的研究提供了理論基礎(chǔ)