江蘇省新城疫病毒分子流行病學(xué)研究及鴿源分離株基因組序列的分析.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒屬中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的多種禽類發(fā)生感染和死亡的一種急性、接觸性傳染病。目前NDV已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了四次大的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)分離自江蘇地區(qū)的20株NDV進(jìn)行了囊膜糖蛋白基因(F、HN)的序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析，根據(jù)分析結(jié)果選取部分毒株進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究。同時(shí)，為豐富基因V

2、I型NDV的分子生物學(xué)信息，進(jìn)而為深入了解基因Ⅵ型病毒的致病特性提供依據(jù)，本研究對(duì)分離到的四株鴿源基因VI型病毒進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定及分析，并根據(jù)這些結(jié)果對(duì)鴿源基因Ⅵ型病毒的宿主特異性及毒力差異性的可能原因進(jìn)行了初步探討。 1.新城疫病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué) 2007-2008年自我國(guó)江蘇部分地區(qū)的發(fā)病禽群中共分離鑒定到1株鵝源、4株鴿源、1株鴕鳥(niǎo)源和14株雞源NDV。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得了20株NDV的F基

3、因序列，遺傳進(jìn)化分析表明，20株NDV中有2株基因I型、6株基因II型、4株為基因VI型，7株基因VII型，還有一株屬于classI毒株。序列相似性分析顯示，兩株基因I型病毒與疫苗株V4/Queensland/66的相似性最高，6株基因II型毒株與疫苗株LaSota的相似性最高，推測(cè)為疫苗毒；7株基因Ⅶ型病毒與F48E8的相似性在90％以下，而與VIId亞型病毒的相似性較高，為VIId亞型；一株classI毒株與中國(guó)近年分離的毒株相似性

4、高，而與DER49/99的相似性較低。由此看出，目前VIId亞型在我國(guó)禽群中仍然十分流行，并且禽群中疫苗株帶毒情況比較明顯，NDV在我國(guó)的流行已呈現(xiàn)出多種基因型并存的狀況。 對(duì)HN基因整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測(cè)序最終獲得了20株NDV的HN基因編碼區(qū)序列。對(duì)其編碼多肽長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，基因I型病毒編碼多肽長(zhǎng)度為585或616個(gè)，6個(gè)基因II型病毒均為577個(gè)，4個(gè)基因Ⅵ型病毒和7個(gè)基因VII型病毒均為571個(gè)。根據(jù)HN基

5、因編碼區(qū)繪制的遺傳發(fā)生樹(shù)與根據(jù)F基因繪制的遺傳發(fā)生樹(shù)高度一致，進(jìn)一步證實(shí)了NDV的演化是在基因水平上整體進(jìn)行的。 對(duì)基因VI型、VII型病毒進(jìn)行的MDT、ICPI、IVPI的測(cè)定結(jié)果顯示，基因VII型病毒的毒力與根據(jù)F基因裂解位點(diǎn)序列及HN基因編碼多肽長(zhǎng)度確定的毒力結(jié)果一致，而對(duì)于基因VI型病毒，兩者之間存在偏差。分離株與針對(duì)NDV囊膜糖蛋白(F、HN)的單克隆抗體排譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與HN蛋白單抗(681)不發(fā)生反應(yīng)的毒株有增多

6、的趨勢(shì)。 2.四株鴿源新城疫病毒全基因組序列的測(cè)定及序列分析 通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)四株鴿源NDV的全基因組序列進(jìn)行了擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測(cè)序獲得了四株病毒的全基因組序列。序列分析顯示，四株病毒全長(zhǎng)均為15192個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)，其中6堿基插入的位置與基因VII型病毒相同。根據(jù)F基因高變區(qū)繪制的遺傳發(fā)生樹(shù)顯示，這4株病毒與1987-2002年間歐洲及日本的分離株同屬于VIb亞型中的EU/re(recent

7、 European，EU/re)分支，顯示了這些地區(qū)在流行病學(xué)方面的相關(guān)性。根據(jù)全基因序列、F基因和HN基因分別繪制的3種遺傳發(fā)生樹(shù)高度一致，表明NDV的遺傳演化是在全基因組水平上進(jìn)行的。基因VI型與其它基因型病毒之間各蛋白氨基酸序列相似性分析顯示：NDV6個(gè)基因中P基因的變異最大，而L基因相對(duì)保守：基因VI型病毒與基因II型病毒的相似性較低；而與基因IV、VII、VIII型病毒的相似性較高，這反映了基因VI型病毒與基因IV、VII、V

8、III型病毒之間在遺傳進(jìn)化上存在一定的相關(guān)性。對(duì)鴿源病毒與雞源病毒各個(gè)基因編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，鴿源毒株在NP、P、L上均出現(xiàn)了幾個(gè)特征性的氨基酸位點(diǎn)，分別是NP蛋白的463(N→D)、469(P→I)及477(P→H)位；P蛋白的10(D→E)、93(T-K/R)及163(R→G)位；HN蛋白的122(G→R)位；L蛋白的1110(L→T/A)及1757(A→V)位。在M、F蛋白上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異的氨基酸位點(diǎn)，在HN蛋白上只發(fā)