蒙古冰草抗旱相關基因克隆、表達及RNAi載體構(gòu)建.pdf

1、蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是我國荒漠草原和典型草原優(yōu)良的禾本科牧草，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄、抗病蟲等優(yōu)異特性，是牧草和農(nóng)作物抗性改良的重要基因資源。同時，蒙古冰草是冰草屬中珍貴的二倍體物種，不僅具有較高的飼用價值，還具有重要的生態(tài)價值和遺傳育種價值。我國擁有豐富的蒙古冰草種質(zhì)資源，開展蒙古冰草抗逆性基因資源的挖掘和利用，對于我國蒙古冰草種質(zhì)資源的保護和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。本研究以蒙古冰草為材

2、料，開展了以抗旱基因為主的受逆境脅迫表達基因的克隆及其抗逆分子機制研究，主要結(jié)果如下： 1.采用PCR和RACE技術，從蒙古冰草中克隆了1個第四組LEA基因，命名為MwLEA。該基因cDNA全長961bp，編碼171個氨基酸。具有LEA—4超基因家族N端特征結(jié)構(gòu)域，C端序列不具備保守性，二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占主導，該基因前140個氨基酸的親水性較強，尾部序列親水性減弱，受干旱脅迫誘導表達。 2.采用RT—PCR技術，從蒙古冰草中克隆了1個

3、第三組LEA基因家族成員，命名為MwLEA3，基因全長1004bp，包含3個內(nèi)含子區(qū)和3個外顯子區(qū)，編碼189個氨基酸。具有8個重復的11aa—基元序列，氨基酸組成中丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸三種氨基酸約占總量的50％，不含半胱氨酸和色氨酸。二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占主導，親水性較強，經(jīng)Southern雜交分析，認為該基因在基因組中以基因家族形式存在。 3.采用RT—PCR方法對MwLEA3基因的表達模式分析顯示，該基因在根莖中的表達量高于葉片中

4、的表達量；受干旱、高鹽、外源激素ABA的誘導，在植物體內(nèi)高水平表達。不同誘導條件下的基因表達模式存在差異。為深入研究MwLEA3基因的功能，以MwLEA3基因為靶標構(gòu)建了RNAi表達載體pRNAiMwLEA3。 4.采用RT—PCR方法從蒙古冰草中克隆到肌動蛋白（Actin）基因，命名為MwACT。在誘導表達分析中，MwACT不受外界因素誘導表達量恒定，是組成型表達的管家基因。為研究其他基因在蒙古冰草中表達提供內(nèi)標參照。 5.從蒙古冰草

5、中克隆到谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶（GSTs）類基因，命名為MwGSTs，該基因具有GSTs超基因家族保守結(jié)構(gòu)域（C—terminal alpha helical domain）。二級結(jié)構(gòu)和親疏水性分析表明，MwGSTs基因具有結(jié)合疏水底物的H位點和較強的疏水特性。 6.本研究克隆的4個基因均與小麥同類基因高度同源，從遺傳進化方面闡明了蒙古冰草進化程度與小麥接近。從理論上支持了蒙古冰草是小麥野生近緣種這一觀點，從而確定蒙古冰草為小麥抗性改良基