轉(zhuǎn)尖音庫(kù)蚊羧酸酯酶及其突變基因果蠅的殺蟲劑抗性研究.pdf

1、蚊蟲由于其特殊的行為、生理以及與人類生活關(guān)系緊密而成為傳播人類疾病如絲蟲病、乙型腦炎、西尼羅河病毒、登革熱、瘧疾等的重要媒介。殺蟲劑對(duì)控制這些人類疾病的主要傳播媒介起著重要的作用,然而由于這些蚊蟲通常具有強(qiáng)大的生殖力和遺傳的可塑性從而適應(yīng)多種嚴(yán)酷自然環(huán)境的變化而生存。自20世紀(jì)以來多種化學(xué)殺蟲劑(有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等)和生物殺蟲劑的使用,使得蚊蟲與這種環(huán)境變化協(xié)同進(jìn)化——通過生理生化多種機(jī)制產(chǎn)生抗藥性,以適應(yīng)

2、各種選擇壓。蚊蟲抗藥性的分子機(jī)理主要包括兩個(gè)方面:代謝抗藥性(如非特異性羧酸酯酶、P450單加氧酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的擴(kuò)增)和靶標(biāo)抗藥性(如乙酰膽堿酯酶、GABA受體和電壓門控鈉離子通道的突變)?？顾幮詥栴}的出現(xiàn)和加劇不僅縮短了當(dāng)前正在使用的殺蟲劑的壽命,而且由于交叉抗性和抗性機(jī)制的多元化,新開發(fā)的殺蟲劑的功效和使用壽命也被大大降低。
　　 目前,已經(jīng)證實(shí)了果蠅的DmαE7a、家蠅的MdαE7、羊綠蠅的LcαE7及在體外蚊蟲的

3、羧酸酯酶B1都可以通過點(diǎn)突變獲得有機(jī)磷水解酶的活性。然而,尖音庫(kù)蚊野生種群里還未檢測(cè)到這種突變體,所以在自然進(jìn)化中羧酸酯酶B1的突變能否給尖音庫(kù)蚊帶來相應(yīng)的抗藥性仍存在著爭(zhēng)議。為解決這一問題,本研究利用果蠅模型,對(duì)羧酸酯酶B1的突變對(duì)蚊蟲抗藥性的影響及其遺傳進(jìn)化進(jìn)行了探討。
　　 通過生物信息學(xué)分析,首先確定了蚊蟲羧酸酯酶B1與果蠅?mèng)人狨ッ傅陌被嵝蛄芯哂休^低的同源性(13％-41％)。利用GAL4／UAS系統(tǒng),通過顯微注射成功

4、構(gòu)建了轉(zhuǎn)尖音庫(kù)蚊羧酸酯酶B1W271及其突變基因B1L271的果蠅品系,經(jīng)過P因子定位,分別得到12瓶和14瓶位于Ⅱ和Ⅲ染色體上的轉(zhuǎn)基因果蠅。實(shí)時(shí)定量PCR顯示,B1W271(Ⅱ)、B1W271(Ⅲ)、BU271(Ⅱ)和B1L271(Ⅲ)四個(gè)轉(zhuǎn)基因果蠅品系插入的基因都是單拷貝,在轉(zhuǎn)錄水平上也沒有顯著性差異。利用兔抗尖音庫(kù)蚊羧酸酯酶B1多克隆抗體,用Western-blot檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因果蠅品系的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的表達(dá)量

5、顯著高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),只檢測(cè)到B1L271(Ⅱ和Ⅲ)微弱的表達(dá)量。經(jīng)過淀粉凝膠電泳對(duì)羧酸酯酶進(jìn)行活性顯色,發(fā)現(xiàn)B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的羧酸酯酶活性明顯高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),大約是B1L271(Ⅱ和Ⅲ)的2-3倍,說明B1W271在突變之后喪失了原有的羧酸酯酶活性。通過對(duì)馬拉硫磷、1605、溴氰菊酯三種農(nóng)藥的生物測(cè)定發(fā)現(xiàn),B1L271對(duì)馬拉硫磷的抗藥性明顯高于B1W271,對(duì)1605和溴氰菊酯都沒有產(chǎn)生抗藥性,說明B1L2