家蠶中腸羧酸酯酶基因的克隆及槲皮素和有機磷殺蟲劑誘導表達.pdf

1、羧酸酯酶是一種廣泛分布于動物、植物和細菌等生物的多功能酶系。由于序列的差異和底物的不同，COEs可分為八類：gliotactin，α-酯酶，乙酰膽堿酯酶，β-酯酶，神經趨化蛋白，glutactin，保幼激素酯酶和神經連接蛋白。研究表明，COEs在昆蟲對殺蟲劑的抗性和降解毒物的過程中起到關鍵作用。中腸做為昆蟲代謝外源有毒物質的主要場所，其內有大量的解毒酶表達。研究發(fā)現家蠶中腸特異表達的COEs能被有機磷殺蟲劑顯著誘導，暗示它們在外源有毒物

2、質的代謝中發(fā)揮重要作用。本文以家蠶大造品系為材料，選取家蠶幼蟲中腸內特異表達的α-家族羧酸酯酶基因Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27進行了克隆和序列分析，同時研究了桑葉次生代謝物質槲皮素和3種常用的有機磷殺蟲劑（辛硫磷，毒死蜱和敵敵畏）對這4個基因表達的影響。另外，還測定了，OPs暴露后，家蠶中腸COE酶活性的變化。主要結果如下：
　　1.經cDNA克隆，獲得家蠶羧酸酯酶Bmae2、Bmae17、Bmae18和B

3、mae27基因的完整編碼區(qū)序列長度分別為1626bp、1629bp、1596bp和1680bp。
　　2.利用Signal IP4.0在線預測發(fā)現Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27分別含有一個20、20、17和14個氨基酸的信號肽，暗示它們可能為分泌蛋白。與其它昆蟲相關的多條COEs序列比較結果顯示，Bmae2和Bmae17保留羧酸酯酶活性必須的催化殘基 Ser、Glu和 His，也保持著α/β-酯酶家族的特征基

4、序Gly-x-Ser-x-Gly。但Bmae18和Bmae27的Ser殘基分別突變?yōu)锳sp和Gly殘基。因此，推測Bmae2和Bmae17可能仍保持著酯酶的水解活性。
　　3.表達譜檢測表明：Bmae2、Bmae17、Bmae18和 Bmae27均在家蠶中腸特異表達，暗示這4個基因可能在家蠶中腸對外源有毒物質的代謝過程中起重要作用。
　　4.有機磷殺蟲劑暴露后家蠶中腸羧酸酯酶活性變化：用3種殺蟲劑誘導處理的家蠶5齡第2天幼蟲

5、，其中腸COEs活性有顯著地提高，毒死蜱、辛硫磷、敵敵畏的低/高濃度處理組誘導的最高酶活性分別是對照組的1.63/1.16、1.92/1.33、2.48/1.68倍。
　　5.槲皮素暴露下中腸特異表達羧酸酯酶基因表達的變化：Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27均能被槲皮素誘導，最大誘導倍數分別為6.90、2.21、1.30和8.78倍。
　　6.經OPs處理家蠶后對克隆所得4個COEs基因表達量的變化：經半定

6、量PCR和熒光定量PCR檢測，Bmae17和Bmae27在低濃度辛硫磷處理3天內均上調表達，與酶活檢測結果基本一致，推測這2個基因可能主要參與對辛硫磷的解毒作用：敵敵畏處理組家蠶只有在處理第3天時中腸內的Bmae17、Bmae18和Bmae27的表達量顯著上調，在處理的前兩天呈現出被抑制或與對照無顯著差異的現象，毒死蜱處理組也出現類似現象，與酶活檢測結果不完全一致，推測中腸表達的其它COEs可能參與了這2種農藥的解毒。
　　以上結