合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記的分離篩選及F2代家系的遺傳多樣性分析.pdf

1、合浦珠母貝(Pinctada fucata)是我國海水珍珠養(yǎng)殖的重要育珠貝,在我國海水珍珠產(chǎn)業(yè)中占有重要的位置。本研究利用FIASCO法進行了新的微衛(wèi)星序列篩選,同時對實驗室以前設(shè)計的微衛(wèi)星引物、根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫的EST序列設(shè)計的引物以及文獻發(fā)表的引物進行了篩選,然后利用篩選的有效引物對大亞灣隨機群體和F2家系進行了遺傳變異分析,主要結(jié)構(gòu)如下:
　　1.微衛(wèi)星引物篩選。(1)采用生物素標(biāo)記的(AC)15探針和磁珠富集法構(gòu)

2、建合浦珠母貝基因組 DNA微衛(wèi)星富集文庫。隨機挑選2097個克隆進行篩選,得到483個候選克隆(23.03％),對其中135個陽性克隆測序分析發(fā)現(xiàn)122個克隆含有微衛(wèi)星重復(fù)單元(90.37%)。進一步通過序列比對,獲得65個具有特異微衛(wèi)星序列的陽性克隆(53.28%),其中包含85個微衛(wèi)星 DNA結(jié)構(gòu)域,其完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和混合型(compound)分別占82.36%、8.24%和9.41%,重復(fù)

3、次數(shù)主要分布于5~20之間(95.74%),平均重復(fù)次數(shù)為7.83,(AC/GT)n重復(fù)所占比例最高(75.53%)。利用Primer Premier5.0設(shè)計了65對微衛(wèi)星引物,通過三亞養(yǎng)殖群體篩選,共獲得20個新的可穩(wěn)定擴增的位點,其中14個具多態(tài)性;20個新位點經(jīng) F2代家系篩選,19對穩(wěn)定擴增;(2)對本實驗室以前發(fā)表的多態(tài)引物進行 F2代家系篩選,共獲得4個可穩(wěn)定擴增的位點;(3)對本實驗室設(shè)計的微衛(wèi)星引物進行 F2代家系篩選

4、,共獲得35個可以穩(wěn)定擴增的位點;(4)對文獻中已發(fā)表引物進行 F2代家系篩選,共獲得36個可以穩(wěn)定擴增的位點;(5)對 GeneBank中合浦珠母貝 EST序列設(shè)計18對微衛(wèi)星引物,并進行 F2代家系篩選,共獲得11對新的可穩(wěn)定擴增的位點。共獲得105個有效擴增位點。這些位點可用于合浦珠母貝群體及家系的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究。
　　2.大亞灣群體的遺傳多樣性分析。利用上述20個位點中的5個對大亞灣隨機種群進行了遺傳多

5、樣性分析,共檢測到29個等位基因,片段長度范圍為122~402 bp。各位點等位基因數(shù)2~9個,平均等位基因數(shù)(A)5.8個;有效等位基因數(shù)(Ae)為1.5957~5.6962,平均為2.9554;觀測雜合度(Ho)為0.3000~0.7000,平均0.4400;期望雜合度(He)為0.3797~0.8384,平均0.5737;多態(tài)性信息含量(PIC)為0.3573~0.8048,平均0.5204(>0.5)。實驗結(jié)果表明,大亞灣群體的

6、遺傳多樣性非常豐富。
　　3. F2代家系遺傳多樣性分析。多樣性分析結(jié)果顯示,F2代家系 Shannon指數(shù)及 Nei's基因多樣性指數(shù)平均值分別為0.6433和0.4226,表明 F2代家系具有較高的遺傳多樣性。共105個微衛(wèi)星位點用于F2代家系及其親本基因型的檢測,分析結(jié)果顯示,有72個位點在至少一個親本及子代中發(fā)生分離,多態(tài)位點比例高達68.57%。親本多態(tài)位點數(shù)占總有效擴增位點數(shù)的比例(68.57%)稍高于子代(67.62

7、%),表明 F2代家系的遺傳多樣性有所降低。遺傳相似度分析顯示,F2代家系與親本間的平均遺傳相似度為0.9722,家系個體間相似性指數(shù)位于0.6280~0.8836之間,平均0.7663。F2代家系與親本間的遺傳分化指數(shù)為 FST=0.0110。聚類分析結(jié)果顯示,F2代中72個個體和父母本聚為一大支,其余22個個體另聚為一大支,兩代中有14個個體(14.58%)兩兩聚為7支,其余82個體分別單獨聚群。研究結(jié)果表明,兩代家系間遺傳分化處于

8、低度水平,沒有明顯的遺傳分化。
　　4.標(biāo)記在親本及 F2代家系中的遺傳分離。根據(jù) Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(PHW),72個位點中有23個(31.94%)處于平衡狀態(tài)(PHW>0.05),其他49個位點(68.06%)都不同程度地偏離了平衡。?2檢驗表明,23個標(biāo)記顯著偏離孟德爾遺傳分離比例(P<0.05,31.94%),其中15個偏分離位點表現(xiàn)為雜合子過剩、純合子缺失,另外7個偏分離位點表現(xiàn)為純合子過剩,而雜

9、合子不足,1個處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài);共有25個微衛(wèi)星標(biāo)記在父本中發(fā)生分離,其中偏分離標(biāo)記數(shù)(4個)占父本總分離標(biāo)記數(shù)的16%,有11個微衛(wèi)星標(biāo)記在母本中發(fā)生分離,偏分離標(biāo)記數(shù)(3個)占母本總分離標(biāo)記數(shù)的27.27%,可見雄性偏分離標(biāo)記的比例明顯低于雌性,在性別間呈現(xiàn)了顯著差異。49個位點符合孟德爾遺傳分離比例,共得到父本特有標(biāo)記21個,可用于雄性遺傳圖譜的構(gòu)建;母本特有標(biāo)記8個,可用于雌性遺傳圖譜的構(gòu)建;父母本共享標(biāo)