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文檔簡介
1、哮喘病是一種常見的呼吸道慢性炎癥疾病,是指支氣管在高反應(yīng)狀態(tài)下,由變應(yīng)原或其他因素引起的氣道狹窄的疾病,主要癥狀有胸悶、咳嗽、呼吸困難等。氣道平滑肌細(xì)胞﹙Airway Smooth Muscle Cell,ASMC﹚是呼吸道的主要組成部分之一,具有重要的生理作用。當(dāng)氣道平滑肌在受到外來因子的刺激時會發(fā)生氣道過度收縮反應(yīng)(Airway hyperrespinsiveness,AHR),臨床表現(xiàn)為患者氣道過度縮窄和發(fā)作性呼吸障礙,這是導(dǎo)致哮
2、喘病成為高危疾病的最終原因所在。雖然在哮喘病的研究當(dāng)中,對ASMC收縮特性的認(rèn)識已經(jīng)有一個多世紀(jì),但是關(guān)于氣道平滑肌病理變化的機(jī)制卻沒有研究透徹。氣道平滑肌是控制氣管管徑的效應(yīng)器,其病理性收縮成為氣道阻塞和呼吸困難的最終因素,它在決定哮喘病治療方法的有效性方面起到關(guān)鍵的作用,普遍認(rèn)為其病理性收縮是哮喘難治的重要的病理基礎(chǔ)。去整合素堿金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloprotease33,ADAM33)基因
3、已被證實是一個哮喘易感基因,且在大部分哮喘患者的氣道平滑肌和基底膜上其表達(dá)水平較健康受試者要高,說明 ADAM33可能參與 ASMC力學(xué)環(huán)境的調(diào)控,進(jìn)而與哮喘病人ASMC力學(xué)特性異常及氣道重構(gòu)有關(guān)。然而,至今還沒有直接的證據(jù)證明 ASMC生物力學(xué)行為與其 ADAM33表達(dá)之間的關(guān)系。因此,本文采用分子生物學(xué)方法調(diào)控 ASMC的ADAM33表達(dá),同時采用細(xì)胞生物力學(xué)方法測量超表達(dá)和沉默 ADAM33的ASMC的力學(xué)行為,以揭示二者之間的直
4、接關(guān)系。本文的主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
?、貯DAM33的表達(dá)水平隨著SD大鼠霧化周數(shù)的增加而顯著性升高。首先,利用氫氧化鋁作為佐劑,卵清蛋白(OVA)致敏并激發(fā)哮喘,建立 SD(Sprague Dawley)大鼠哮喘模型。每周隔天OVA霧化3次,每次30分鐘,共霧化12周,每2周取大鼠肺組織。通過對肺功能(Penh)的測定及氣道組織 HE(Hematoxylin-Eosin staining)染色觀察結(jié)果表明我們已成功構(gòu)建
5、大鼠哮喘模型。接著,利用定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測ADAM33在OVA霧化不同周數(shù)的SD大鼠哮喘平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示 ADAM33的表達(dá)水平隨著 OVA霧化周數(shù)的增加而顯著性升高,且定量RT-PCR與Western blot的實驗結(jié)果基本一致。從而說明ADAM33的表達(dá)水平與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),該結(jié)果與Lee等在哮喘病人中的研究發(fā)現(xiàn)相符合,更近一步證明我們實驗中所構(gòu)建的SD大鼠哮喘模型能真實地模擬哮喘
6、病。
?、讷@得ADAM33超表達(dá)和沉默的ASMC。首先,構(gòu)建ADAM33基因超表達(dá)和干擾慢病毒重組載體,然后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染,以GFP空載及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。在熒光顯微鏡下觀察到重組慢病毒轉(zhuǎn)染正常SD大鼠ASMC,24h后GFP表達(dá)逐漸增強(qiáng),至培養(yǎng)72h時GFP表達(dá)最強(qiáng)到高峰,并發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI(Multiplicity of Infection)=100時,慢病毒感染ASMC的效率為95%。定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,超表達(dá)組
7、ADAM33基因表達(dá)水平是正常對照組的8倍(P<0.01),沉默組中pLVT453沉默效率最高達(dá)到75%(P<0.01);同時,Western blot測定各組細(xì)胞的ADAM33蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明,超表達(dá)組細(xì)胞內(nèi) ADAM33蛋白表達(dá)較兩組對照明顯增高(P<0.01),而沉默組表達(dá)明顯降低(P<0.01),ADAM33蛋白在兩組對照組中的表達(dá)量無明顯差別。本實驗成功獲得了穩(wěn)定的ADAM33超表達(dá)和沉默ASMC,且重組慢病毒轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)
8、或抑制了ASMC中ADAM33基因mRNA和蛋白的表達(dá)。
③ADAM33基因表達(dá)水平的變化改變了ASMC的遷移能力和增殖能力。采用MTT法觀察不同4組細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)組pLV-ADAM33的細(xì)胞增殖能力與空白對照組相比沒有顯著性差異;而沉默組pMa-ADAM33相對于對空白照組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。GFP對照組的細(xì)胞增殖能力顯著低于未轉(zhuǎn)染對照組(P<0.01),由此我們可以看出慢病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖能力有
9、抑制作用,雖然上調(diào)ADAM33對細(xì)胞增殖能力對于未轉(zhuǎn)染對照組來說無差異,但是相對GFP對照組的細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)。劃痕法(Wound healing)檢測細(xì)胞橫向遷移能力的結(jié)果顯示,在12h時,4組細(xì)胞遷移無明顯差異。但是在24h時,超表達(dá)組pLV-ADAM33的橫向遷移能力與兩組對照相比明顯增強(qiáng)(P<0.01)(P<0.05);而沉默組pMa-ADAM33的細(xì)胞顯著降低(P<0.01),該結(jié)果表明通過特異性改變ADA
10、M33基因的表達(dá),能夠影響ASMC橫向遷移能力。
④ADAM33基因能調(diào)控 ASMC的細(xì)胞基礎(chǔ)剛度、收縮力及牽張力等細(xì)胞力學(xué)特性。運(yùn)用光學(xué)捕捉(Optical trapping)與磁力扭轉(zhuǎn)細(xì)胞測量術(shù)(Magnetic Twisting Cytometry)和傅里葉變換牽引力顯微術(shù)(Fourier Transform Traction Microscopy,F(xiàn)TTM)檢測由慢病毒轉(zhuǎn)染所獲得的穩(wěn)定超表達(dá)和干擾ADAM33的ASMC
11、的生物力學(xué)特性。研究結(jié)果顯示:1)超表達(dá)ADAM33的ASMC組pLV-ADAM33的細(xì)胞基礎(chǔ)剛度、KCL激動劑處理后的收縮力、牽張力顯著高于對照組,而 ADAM33沉默的細(xì)胞組其上述參數(shù)明顯低于對照。2)共聚焦免疫熒光結(jié)果顯示 ADAM33和黏著斑蛋白vinculin存在共定位關(guān)系,并且還有部分ADAM33有沿著應(yīng)力纖維分布的情況,說明ADAM33可能調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和粘著斑的形成。3)通過定量RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADMA33基
12、因表達(dá)水平的改變能調(diào)控細(xì)胞力學(xué)相關(guān)基因Calponin和Integrin-β1的表達(dá)。
從以上實驗結(jié)果,我們推測:調(diào)控ADAM33的表達(dá)直接影響到ASMCs的生物力學(xué)行為,提示ASMCs的生物力學(xué)行為與其ADAM33的表達(dá)存在直接的聯(lián)系。因此,哮喘患者中ADAM33基因表達(dá)及修復(fù)的異常有可能在氣道重塑和氣道收縮高反應(yīng)性等方面扮演決定性的角色,這對于深入理解哮喘的發(fā)病機(jī)制,特別是氣道功能變換的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制,從而探尋有效的哮喘治療
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