SV40T抗原基因的穩(wěn)定轉染及對人胃癌細胞SGC7901的生物學效應.pdf

1、猴病毒40(Simian virus40,SV40)是一種DNA腫瘤病毒,在體外可以轉化細胞并誘發(fā)動物體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤,在人類多種腫瘤中已檢測到SV40基因的存在和表達。SV40與人類腫瘤關系密切,它的致瘤性和轉化細胞能力主要與其編碼的早期蛋白T抗原(T antigen,Tag)有關。SV40Tag能夠和抑癌蛋白p53和Rb等結合并使之失活,導致細胞生長失控和惡性增殖,被認為是SV40Tag致瘤發(fā)生的重要機制。SV40Tag可以整合入細胞基

2、因組中破壞其結構和穩(wěn)定性,反式激活細胞基因的表達并啟動宿主DNA的復制轉錄等。SV40Tag對細胞轉化起決定性作用,與細胞增殖及腫瘤發(fā)生密切相關,它可以誘發(fā)轉基因動物產(chǎn)生多種類型腫瘤,被廣泛用于腫瘤發(fā)生機制的研究。
　　利用SV40Tag基因與組織表達特異性的啟動子相結合,已經(jīng)成功制備多種轉基因小鼠腫瘤模型。H+/K+ATPase基因在胃壁細胞中特異性表達,利用胃壁細胞特異性H+/K+ATPaseβ亞基啟動子建立SV40Tag基因

3、轉基因小鼠胃癌模型,可用于胃癌發(fā)病機制的研究,同時為胃癌的預防和治療提供有力的工具。
　　在以往研究的基礎上,本實驗將H+/K+ATPaseβ亞基啟動子驅(qū)動表達SV40Tag基因的真核表達載體pcDNA3.1(-)/HKSV轉染入SGC7901、EC9706和KB細胞中,通過G418篩選和擴大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定轉染的細胞系。應用PCR、RT-PCR和免疫細胞化學染色方法檢測SV40Tag基因在穩(wěn)定轉染細胞中的整合與表達情況,并且觀察S

4、V40Tag基因的表達對人胃癌細胞SGC7901生物學特性的影響,探討SV40Tag的作用機制及SV40Tag基因表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系,為進一步轉基因動物模型的構建奠定理論及實驗基礎。
　　材料與方法:
　　1.質(zhì)粒的擴增、提取和酶切鑒定提取質(zhì)粒pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV,利用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定質(zhì)粒,將質(zhì)粒用BamHⅠ酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　2.

5、細胞轉染利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000,將含有SV40Tag基因的真核表達載體pcDNA3.1(-)/SV和pcDNA3.1(-)/HKSV轉染入SGC7901、EC9706和KB細胞中,用G418進行篩選,將獲得的陽性細胞克隆擴大培養(yǎng),得到體外穩(wěn)定傳代的轉染細胞系。
　　3.檢測穩(wěn)定轉染細胞中SV40Tag基因的表達SV40Tag基因穩(wěn)定轉染后,從DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個水平上檢測SV40Tag基因的整合和表

6、達。提取轉染及未轉染細胞的基因組DNA,利用Tag基因特異性引物PCR擴增檢測SV40Tag基因的表達;提取細胞總RNA,RT-PCR檢測SV40Tag基因mRNA的表達;免疫細胞化學染色檢測穩(wěn)定轉染及未轉染細胞中SV40Tag的表達。
　　4.檢測轉染SV40Tag基因的SGC7901細胞生物學特性變化MTT法檢測SV40Tag基因轉染前后SGC7901細胞增殖能力變化;應用流式細胞術進行細胞周期分析。
　　5.統(tǒng)計學處理

7、SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,數(shù)值用均數(shù)±標準差(±s)表示。應用單因素方差分析進行組間差異比較,以α=0.05為檢驗水準。
　　結果:
　　1.質(zhì)粒的酶切鑒定pcDNA3.1(-)/HKSV用BamHⅠ單酶切電泳,可見到約2.7kb與6.4kb兩條DNA條帶;pcDNA3.1(-)/SV用BamHⅠ單酶切電泳,可見到約2.7kb與5.4kb兩條DNA條帶;pcDNA3.1(-)用BamHⅠ單酶切電泳,僅見到

8、一條5.4kb的DNA條帶,與預期結果相符,可用于下一步的實驗。
　　2.PCR各組細胞均可擴增出443bp的內(nèi)參照GAPDH條帶,pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉染的SGC7901、EC9706和KB細胞均可擴增出618bp的SV40Tag基因特異性條帶,未轉染細胞與空質(zhì)粒轉染細胞均無此條帶出現(xiàn)。
　　3.RT-PCR各組細胞均擴增出443bp的內(nèi)參照GAPDH條帶,pcDNA3.1(-

9、)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉染的SGC7901、EC9706和KB細胞均擴增出272bp的SV40Tag基因特異性條帶,未轉染細胞與空質(zhì)粒轉染細胞檢測不到此條帶。
　　4.免疫細胞化學染色pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉染的SGC7901、EC9706和KB細胞中均檢測到SV40Tag的陽性表達,未轉染細胞與空質(zhì)粒轉染細胞無SV40Tag的表達。
　　5.MTT結果pc

10、DNA3.1(-)/HKSV和pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉染的SGC7901細胞的生長增殖速度比未轉染細胞及空質(zhì)粒轉染細胞明顯加快,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),未轉染細胞和空質(zhì)粒轉染細胞之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　6.流式細胞術檢測細胞周期結果pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉染的SGC7901細胞中G1期細胞比例減少及PI指數(shù)增加,與未轉染SGC7901細胞和空質(zhì)粒p