人結(jié)腸癌CW-2干細胞的分離純化和生物學特性研究.pdf

1、目的：分選、培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株CW-2干細胞。比較3種細胞分選方法對人結(jié)腸癌細胞株CW-2干細胞的富集效率，探討獲得腫瘤干細胞的有效方法。探討人結(jié)腸癌細胞株CW-2干細胞生物學特性。
　　 方法：采用單純無血清懸浮培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑+流式細胞分選術（多重聯(lián)合）分別對人結(jié)腸癌細胞株CW-2干細胞進行分離、培養(yǎng)。然后應用流式細胞術、體內(nèi)NOD-SCID小鼠致瘤實驗和體外Transwell侵襲實驗

2、比較3種方法的富集效率。選擇較為有效的分離方法富集人結(jié)腸癌CW-2干細胞，并采用流式細胞術檢測富集前后細胞中CD44+EPCAM+細胞含量、細胞分化實驗、細胞周期檢測、體外侵襲實驗、體內(nèi)成瘤實驗、免疫組化檢測移植瘤中CD44和EPCAM細胞的表達情況和移植瘤H&E染色對腫瘤干細胞進行生物學特性研究。
　　 結(jié)果：人結(jié)腸癌CW-2細胞在無血清培養(yǎng)液中僅少部分存活并增殖形成懸浮的腫瘤干細胞球。無血清懸浮培養(yǎng)細胞、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙

3、利鉑處理細胞和多重聯(lián)合分選后細胞中具有結(jié)腸癌干細胞特性的CD44+EPCAM+細胞的含量分為57.39％、73.85％、89.57％；分別測量不同時間點（4、7、9、14、21、28d）各組小鼠成瘤情況，多重聯(lián)合分選細胞接種NOD-SCID小鼠后成瘤時間早、瘤體增長速度快，接種后第4、7、9、14、21、28d體積分別為（209.25±31.54）mm3、（500.00±72.90）mm3、（852.75±157.51）mm3、（228

4、0.004±440.91）mm3、（4897.00±1154.15）mm3、（11070.00±3559.86）mm3，與無血清懸浮培養(yǎng)細胞、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細胞的成瘤能力差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；單純無血清懸浮培養(yǎng)細胞、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細胞和多重聯(lián)合分選后細胞接種72h后穿過人工基底膜的細胞數(shù)分別為（98±7）個/視野、（135±7）個/視野、（188±6）個/視野，3組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0

5、5）。故3種分選方法所獲得細胞中干細胞含量由高到低為：多重聯(lián)合分選后細胞、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細胞、單純無血清懸浮培養(yǎng)細胞。CD44+EPCAM+細胞球在含血清培養(yǎng)液中易分化為貼壁生長的細胞，CD44+EPCAM+細胞中G0/G1期細胞占86.19％，G2+S期細胞占13.81％，傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細胞（未分選細胞）中60/61期細胞占69.34％，G2+S期細胞占30.66％，CD44-EPCAM-細胞中G0/G1期細胞占56.0

6、4％，G2+S細胞占43.96％，3群細胞之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CD44+EPCAM+細胞群處于低增殖狀態(tài)，傳統(tǒng)血清培養(yǎng)細胞（未分選細胞）群處于中等增殖狀態(tài)，CD44-EPCAM-細胞處于高增殖狀態(tài)；傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細胞、多重聯(lián)合分選后CD44+EPCAM+細胞、CD44-EPCAM-細胞接種72h后穿過人工基底膜的細胞數(shù)分別為（188±6）個/視野、（56±5）個/視野、（0±0）個/視野，3組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<

7、0.05），CD44+EPCAM+細胞比傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細胞更具有侵襲能力，CD44-EPCAM-細胞無侵襲能力；分別測量不同時間點（4.、7、14、21、28d）各組小鼠成瘤情況，多重聯(lián)合分選后CD44+EPCAM+細胞接種NOD-SCID小鼠后成瘤時間早、瘤體增長速度快，接種后第4、7、14、21、28d體積分別為（209.25±31.54）咖。、（500.00±72.90）mm3、（2280.00±440.91）inna、（4897

8、.00±1154.15）mm3、（11070.00±3559.86）mm3，而傳統(tǒng)血清培養(yǎng)細胞（未分選細胞）接種后成瘤時間相對較晚、瘤體增長速度慢，CD44-EPCAM-細胞大量接種NOD-SCID小鼠后始終無瘤體形成，3組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CD44+EPCAM+細胞成瘤能力強于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細胞和CD44-EPCAM-細胞；移植瘤均在細胞膜和細胞質(zhì)中表達CD44和EPCAM，H&E染色可見細胞核大濃染，核漿比增大，核