GM-CSF抗流感病毒機制及黃芩苷恩替卡韋組合物抗乙肝病毒藥效學研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子抗流感病毒機制研究
　　粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)最初是從小鼠肺條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種能刺激粒細胞和巨噬細胞形成集落的因子。隨著對其研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了促進造血祖細胞的增殖和分化，GM-CSF對成熟白細胞的功能也有激活作用，有助于增強機體

2、的抗感染免疫。本研究在前期的工作中首次證實GM-CSF對FM1流感模型小鼠有顯著的保護作用，經(jīng)GM-CSF預防治療后，能明顯降低流感模型小鼠肺流感病毒滴度，減輕肺組織病變，提高模型小鼠的生存率，該研究結果已于2010年發(fā)表于《Cytokine》雜志上。
　　為了在已有的藥效學研究基礎上進一步闡明GM-CSF抗流感病毒的作用機制，本論文第一部分從炎癥和細胞凋亡兩方面對此進行了較為系統(tǒng)的實驗探索。沿用之前的預防治療方式，經(jīng)滴鼻途徑給予

3、BALB/C小鼠GM-CSF7天，劑量為1.34mg/kg/day，然后再對小鼠感染致死量的A型流感病毒FM1，并于感染病毒的第0天、第2天和第4天各選取一定數(shù)量的小鼠進行解剖，收獲肺標本，分別用ELISA法檢測肺勻漿中的細胞因子，流式細胞術檢測肺組織內免疫細胞的占比，real-time RT PCR技術檢測肺組織內A型流感病毒M基因、NF-κB、caspase3、bax和bcl-2 mRNA表達水平，Western blot檢測NF-

4、κB、磷酸化NF-κB、IκB、caspase3、cleaved caspase3、bax和bcl-2蛋白表達水平，免疫組化檢測肺組織石蠟切片中磷酸化NF-κB和cleaved caspase3的定位表達。
　　數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)GM-CSF預防治療后的小鼠肺TNF-α和IFNα/β生成量顯著增加，在病毒感染早期肺組織內的天然免疫細胞的數(shù)量占比也高于模型對照組，而之后這些細胞因子濃度和粒細胞、單核/巨噬細胞數(shù)量占比下降，均低于模型對照組

5、，該結果表明GM-CSF預防治療可以在病毒感染初期顯著上調機體的抗感染免疫水平并在之后控制機體的免疫應答強度。感染第2天和第4天的A型流感病毒M基因定量分析顯示GM-CSF治療組均顯著低于模型對照組，提示GM-CSF對肺流感病毒載量的有效抑制作用，這可能與GM-CSF及早啟動抗病毒免疫應答，控制了病毒的復制和擴散有關。NF-κB是調控炎癥因子和干擾素表達的重要因子，檢測表明小鼠經(jīng)GM-CSF預防干預后，肺NF-κB mRNA和磷酸化NF

6、-κB蛋白表達增加，并且在感染流感病毒后也穩(wěn)定在相當水平，而模型組小鼠肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白水平在感染病毒后大幅上升，顯著高于GM-CSF干預組。對細胞凋亡相關因子的檢測表明，GM-CSF可以抑制促凋亡因子bax、caSpaSe3和cleaved caspase3的表達，增加抑凋亡因子bcl-2的表達，提示GM-CSF明顯減少流感病毒誘導的細胞凋亡。
　　根據(jù)上述實驗結果我們推測GM-CSF對流感模型小鼠的保

7、護機制:(1)GM-CSF通過激活NF-κ B信號途徑，促進肺抗病毒細胞因子TNF-α和Ⅰ型IFN生成，并且在感染早期有效募集天然免疫細胞，從而控制了病毒的復制和擴散。由于病毒載量的顯著抑制，使得炎癥反應和免疫應答一直控制在適度水平，從而避免了炎癥性病理損傷的發(fā)生;(2) GM-CSF上調抑凋亡因子bcl-2和下調促凋亡因子bax的表達，抑制caspase信號途徑的激活，顯著減少了流感病毒誘導的肺細胞的凋亡和由此導致的嚴重肺損傷。簡言之

8、，GM-CSF的預防干預使機體抗感染免疫水平在感染之初即顯著上調，及早啟動的抗病毒免疫應答，有效控制了流感病毒的復制和擴散，避免了因高病毒載量導致的過度炎癥反應和細胞凋亡的發(fā)生，從而有效保護了流感病毒感染小鼠。該研究結果為GMCSF應用于流感的預治提供了理論基礎。
　　第二部分 恩替卡韋與黃芩苷組合物抗乙肝病毒藥效學研究
　　黃芩苷(baicalin，BA)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis

9、Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)靜、降壓等功效。體外實驗表明，黃芩苷對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制有一定抑制作用，而黃芩苷藥物作為乙肝治療的輔助用藥在臨床上亦有不錯的療效，但是有關黃芩苷抗乙型肝炎病毒的機制尚未見文獻報道。
　　本論文首次對黃芩苷抗乙肝病毒的作用機制進行了探索。分別以黃芩苷50μM、25μM和12.5μ

10、M作用于HepG22.2.15細胞模型，采用ELISA和realtime PCR方法分別檢測細胞上清中HBV抗原和HBV DNA水平，結果顯示黃芩苷對HBsAg, HBeAg和HBV DNA均有一定抑制作用。Northern blot和realtime RT PCR檢測表明黃芩苷顯著減少HepG22.2.15細胞內的HBV2.1/2.4kb和3.5kb RNA表達水平，同時發(fā)現(xiàn)黃芩苷顯著下調宿主細胞的肝細胞核因子HNF1α和HNF4α的

11、表達，而HNF1α和HNF4α都是重要的HBV RNA轉錄的正調控因子，由此推測黃芩苷可能通過下調HNF1α和HNF4α的表達，抑制HBVRNA的轉錄生成，繼而影響病毒蛋白的表達和HBV DNA的合成，從而抑制HBV的復制。
　　本研究又將恩替卡韋(entecavir，ETV)與黃芩苷配伍，分別在HepG22.2.15細胞模型和通過對HBV進行rtM204V+ rtL180M突變（YMDD主要突變類型之一）并建立的拉米夫定耐藥細胞

12、模型中考察了恩替卡韋黃芩苷組合物(ETV+BA)對野生型HBV及拉米夫定耐藥突變HBV的抑制效果。結果表明，在HepG22.2.15細胞模型中，組合物ETV3nM+BA50μM、ETV0.75nM+BA50μM和ETV0.19nM+BA50μM對野生型HBV的HBsAg, HBeAg和HBVDNA的合成均顯示顯著的抑制作用，較之單獨使用ETV干預，對HBsAg抑制率分別提高35.05％、35.67％和39.44％，對HBeAg抑制率分別

13、提高10.99％、12.45％和12.46％，對HBV DNA抑制率分別提高10.66％、13.19％和12.17％。而在HBV拉米夫定耐藥細胞模型中，組合物ETV48nM+BA50μM、ETV16nM+BA50μM、ETV3nM+BA50μM和ETV0.75nM+BA50μM也顯示對HBV rtM204V+ rtL180M突變株的顯著抑制作用，較之單獨使用ETV干預，對HBsAg抑制率分別提高30.00％、30.00％、29.58％和

14、32.92％;對HBeAg抑制率分別提高28.88％、31.08％、32.67％和30.94％;對HBV DNA抑制率分別提高37.60％、41.00％、35.80％和33.88％。
　　以上數(shù)據(jù)表明，相比單獨使用ETV干預，ETV+BA組合物可以提高對野生型HBV和拉米夫定耐藥突變HBV抑制效果，這可能與ETV和BA具有不同抗病毒機制有關，ETV主要通過影響病毒聚酶活性抑制HBV DNA的復制，而BA則通過下調HNF1α和HNF

15、4α表達影響HBV RNA的合成，兩者配伍組合后，作用機制上的互補使得抗HBV效果得以提升。另外，由于HBVYMDD變異株對ETV敏感性明顯減弱，而BA的通過下調宿主的肝細胞核因子影響HBV復制，抗HBV效果不受病毒變異影響，使得ETV+BA組合物對HBVYMDD突變株的抑制效果提升更為顯著，提示ETV+BA組合物在治療HBV拉米夫定耐藥株感染方面可能更具優(yōu)勢。
　　本研究還采用口服給藥方式在鴨乙肝動物模型中進一步考察了該組合物在

16、體內的抗DHBV療效。通過斑點印跡雜交和Southern印跡雜交檢測治療后的鴨血清和肝臟DHBV DNA水平。結果顯示，組合物ETV0.1 mg/kg/d+BA250mg/kg/d和ETV0.025mg/kg/d+BA250mg/kg/d治療13天后，對鴨血清DHBVDNA的抑制率分別達53.61％和46.96％，比單獨使用ETV治療的抑制效果分別提高14.74％和15.03％;對鴨肝臟DHBV DNA的抑制率分別達72.6％和62.8