RNA干擾EP-CAM基因表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、達(dá)量分別為0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(分別為0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot結(jié)果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EP

2、CAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中EP-CAM蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明顯低如空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（分別為0.7969±0.0160、0.8093±0.0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1質(zhì)粒的干擾效果最佳，對(duì)mRNA和蛋

3、白表達(dá)的抑制率分別為(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干擾效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后：①顯微鏡下觀察，干擾組、空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異；②MTT法顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比干擾組細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制（P<0.05）；③流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組細(xì)胞的凋亡率分別為（9.56±0.77）%、（10.57

4、±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。④Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（57±7）明顯少于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（分別為107±9,102±12;P<0.01）。
　　結(jié)論：1、靶向EP-CAM基因的特異性miRNA能有效地降解EP-CAM基因mRNA、抑制EP-CAM蛋白的表達(dá)。2、RNAi技術(shù)沉默人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中EP-CAM基因表達(dá)，能有效地

5、抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖活性及侵襲力。3、EP-CAM基因可能成為膽囊癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。
　　目的:利用RNA干擾技術(shù)沉默膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EP-CAM）基因的表達(dá)，探討沉默EP-CAM基因表達(dá)對(duì)GBC-SD細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡及侵襲力的影響，為膽囊癌的基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1、根據(jù)Genebank

6、 accession number：BC014785提供的基因序列，利用invitrogen公司的在線RNAi設(shè)計(jì)工具,設(shè)計(jì)針對(duì)EP-CAM基因不同位點(diǎn)的4個(gè)特異性miRNA干擾序列；將選擇的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，確信所選擇的序列與其他的基因不具有同源性；以鼠miR-155為骨架構(gòu)建4個(gè)針對(duì)EP-CAM基因的特異性miR RNAi表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。2、用Lipofect-amine?2000介導(dǎo)分

7、別將pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、-2、-3、-4轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株，試驗(yàn)另設(shè)陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA?6.2-GW/-EmGFPmiR-neg）及空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組），瞬轉(zhuǎn)48h后分別用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組GBC-SD細(xì)胞中EP-CAM的mRNA及蛋白的表達(dá)情況，篩選出干擾效率最強(qiáng)的一個(gè)miR RNAi表達(dá)質(zhì)粒。3、用干擾效率最強(qiáng)的pcDNA?6.2-GW/EmG

8、FPmiR–EPCAM-1轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞作為干擾組，觀察GBC-SD細(xì)胞的生物學(xué)行為變化：①顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；②MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化；③Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化；④Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力的變化。
　　結(jié)果：1、DNA測(cè)序分析證實(shí)，表達(dá)質(zhì)粒pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM

9、-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4中的插入片段序列均與設(shè)計(jì)的miRNA oligo序列一致，4個(gè)針對(duì)EP-CAM基因的miR RNAi表達(dá)載體均構(gòu)建成功。2、轉(zhuǎn)染48h后， RT-PCR結(jié)果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmG

10、FPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉(zhuǎn)染組中EP-CAM mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(分別為0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot結(jié)果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–

11、EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中EP-CAM蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明顯低如空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（分別為0.7969±0.0160、0.8093±0.

12、0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1質(zhì)粒的干擾效果最佳，對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)的抑制率分別為(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干擾效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后：①顯微鏡下觀察，干擾組、空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異；②MTT法顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比干擾組細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制（

13、P<0.05）；③流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組細(xì)胞的凋亡率分別為（9.56±0.77）%、（10.57±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。④Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（57±7）明顯少于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（分別為107±9,102±12;P<0.01）。
　　結(jié)論：1、靶向EP-CAM基因的特異性miRNA能有效地降解EP-