乳酸桿菌表面蛋白調控腸上皮細胞粘附及其生物學意義.pdf

1、目的和意義： 應用生物信息學及克隆表達的方法對乳酸桿菌表層粘附蛋白進行篩選和鑒定，并通過抗體封閉及競爭粘附的手段對目的蛋白的粘附作用作進一步的驗證。根據(jù)腸上皮細胞模型(Caco-2細胞)在單獨使用致病性大腸桿菌(EPEC)感染，加用乳酸桿菌或粘附蛋白后的生物學功能改變的不同，包括單層細胞的完整性和通透性、緊密連接(Tight jungtion，TJ)蛋白、F-actin、ERK、p-ERK的表達差異，闡述乳酸桿菌及粘附蛋白對腸上

2、皮細胞緊密連接蛋白及其生物學功能的調控機制。 研究方法： 1、運用生物信息學及克隆表達的方法鑒定和篩選乳酸桿菌表層粘附蛋白； 2、通過同EPEC競爭粘附腸上皮細胞，結合抗體封閉的手段驗證目的蛋白的粘附作用； 3、采用免疫熒光、Western blot方法觀察EPEC、乳酸桿菌或粘附蛋白對腸上皮細胞緊密連接(TJ)相關蛋白Claudin-1蛋白、Occludin蛋白、JAM-1蛋白、ZO-1蛋白分布變化的影

3、響； FITC-phalloidin染色觀察細胞骨架F-actin的表達變化； 4、用Millipore ERS電阻儀測定單層細胞跨膜電阻值(TER)的變化；用高效液相色譜法(HPLC)測定甘露醇溶液的透過率間接反映單層細胞的通透性； 5、結合ERK表達水平的改變，分析乳酸桿菌對腸上皮TJ蛋白的調控機制 6、所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，P<0.05提示差異有統(tǒng)計學意義，采用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析

4、。 結果： 1、通過乳酸桿菌同腸上皮黏蛋白的粘附特性，對乳酸桿菌表層粘附蛋白作篩選及鑒定，運用質譜分析、分段表達克隆及Western blot找到粘附蛋白整合膜蛋白(IMP)，其粘附域位置是IMP的第二段(氨基酸序列的455-755)； 2、通過抗體封閉，在同EPEC的競爭黏附實驗中進一步證實該段黏附蛋白對黏附有重要作用； 2、堿性磷酸酶染色驗證了腸道上皮樣細胞Caco-2具有明顯的細胞極性。免疫膠體金及

5、電鏡觀察證實相鄰上皮細胞間的頂端存在緊密連接結構； 3、EPEC感染可使相鄰Caco-2細胞間TJ結構遭到破壞，TJ相關蛋白(Claudin-1蛋白，Occludin蛋白，JAM-1蛋白，ZO-1蛋白)的表達亦減少，細胞骨架受損，然而腸上皮細胞ERK的磷酸化水平隨緊密連接蛋白水平的降低而升高；而乳酸桿菌和表層粘附蛋白處理后可以減輕EPEC引起的TJ結構及相關蛋白的破壞，ERK的磷酸化水平卻降低明顯； 4、EPEC感染Ca

6、co-2細胞后，單層細胞的TER值降低和甘露醇的透過率隨時間延長而升高；而經(jīng)乳酸桿菌和表層粘附蛋白處理后，TER值恢復且甘露醇的透過率降低。 結論： 植物乳酸桿菌CGMCC No.1258表層黏附蛋白為整合膜蛋白，且該蛋白的粘附區(qū)域位于其第二段氨基酸序列中。乳酸桿菌依賴于粘附蛋白可以同EPEC競爭粘附腸上皮細胞Caco-2，進而可以抑制EPEC的感染后引起的腸道單層上皮完整性、細胞間緊密連接結構和細胞內骨架的破壞，其具體