人骨髓間充質干細胞在精原細胞培養(yǎng)條件下生物學特征的研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)人胚胎骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)，通過hMSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下的生物學特征研究，探討人骨髓間充質干細胞誘導分化為精原細胞的可行性，為hMSCs作為“種子細胞”開辟新的途徑。 方法： 1．骨髓間充質干細胞的分離純化、培養(yǎng)與鑒定：無菌條件下取出脛骨，沖出骨髓液，以Ficoll密度梯度和差速貼壁相結合的方法分離、培養(yǎng)hMSCs。待細胞鋪滿瓶底面積的

2、70％-80％，即進行細胞傳代培養(yǎng)。0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化，離心，重懸細胞并按1：3的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并分別用P2、P3、P4等表示傳代次數(shù)。實驗結果通過下列方法鑒定： (1)倒置顯微鏡下觀察細胞的生物學行為變化； (2)繪制hMSCs的生長曲線：選取生長良好的第2、4、9代細胞用0.25％胰酶消化后以1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，并從第2天起，每天在固定時間，選用5孔細胞分別加入5

3、mg/ml的MTT20μl，混勻，孵育4h后棄培養(yǎng)液，加入150μl二甲基亞砜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測其OD值，取平均值，連續(xù)6d，以時間為橫軸、OD值為縱軸繪制不同代細胞的生長曲線； (3)組織學染色將第三代的細胞培養(yǎng)4天后經(jīng)4％多聚甲醛固定并作常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色； (4)CD44、CD105免疫組化檢測將第三代細胞培養(yǎng)3天后，經(jīng)4％多聚甲醛固定并檢測細胞表面特異性分子標記。 2．人胚胎

4、MSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)及檢測： (1)人胚胎MSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)：取生長良好的第三代hMSCs，用0.25％的胰酶/0.02％EDTA消化，制成單細胞懸液，將其加入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入濃度約為4×104/ml的細胞懸液1ml，將其隨機分組進行培養(yǎng)。對照組：用普通培養(yǎng)基(DMEM+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10％胎牛血清)培養(yǎng)，3-4d換液一次，共培養(yǎng)15d；實驗組：用條件培養(yǎng)基(普通培

5、養(yǎng)基中添加1％人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)+0.1U/ml胰島素+0.1g/L維生素A+0.1g/L維生素E+1％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸鈉)誘導培養(yǎng)hMSCs，3-4d換液一次，共培養(yǎng)15d。 (2)人胚胎MSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后結果檢測：在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化并拍照記錄，待細胞培養(yǎng)至第15d，采用SP法進行細胞免疫組織化學檢測

6、，并嚴格按照說明進行實驗操作，封片、鏡檢并拍照記錄。 結果： (1)原代培養(yǎng)的人胎兒骨髓MSCs在基礎培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)4h后開始變形貼附，經(jīng)過約4d的靜止期后，于培養(yǎng)第5d后開始進入快速增殖階段，即對數(shù)增殖期，此時可見細胞折光性增強，呈旋渦狀或巢狀生長，細胞突起明顯增長，相互交織，培養(yǎng)至9-10天即可鋪滿瓶壁。待傳至第三代時，細胞形態(tài)趨于一致。此時hMSCs靜止期縮短，培養(yǎng)2-3d即進入快速增殖期，第5d起，細胞生長逐漸

7、緩慢，開始進入平臺期。HE染色可見細胞呈長梭行，胞質豐富，核大，單個，圓形或橢圓形，位于細胞中央。免疫組化檢測結果顯示CD44、CD105呈陽性表達，Oct-4、C-kit呈陰性。 (2)人胚胎MSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)結果：實驗組：培養(yǎng)過程中細胞大量死亡、脫落，而存活的細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，于培養(yǎng)第15天時可見細胞突起變少變短，有的甚至看不到突起，胞體由長梭形變成圓形或橢圓形。免疫組織化學顯示此時的細胞膜和細胞質Oct-

8、4、C-kit染色呈陽性，而CD44、CD105呈陰性表達。對照組：培養(yǎng)至第15天，細胞形態(tài)無明顯變化，免疫組織化學檢測Oct-4、C-kit染色呈陰性，CD44和CD105呈陽性。 結論： 1．Ficoll密度梯度和差速貼壁相結合的方法可獲得純化的hMSCs，通過傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第10代，細胞仍生長良好，未出現(xiàn)老化現(xiàn)象，從而成功地建立了hMSCs的體外培養(yǎng)體系； 2．通過不同代細胞生長曲線的研究，發(fā)現(xiàn)傳至第三代

9、的人胚胎MSCs純度高、增殖能力強，是實驗選用的理想細胞； 3．倒置顯微鏡下細胞生物學行為觀察、HE染色、特異免疫組化顯示表面分子標志物CD44、CD105為陽性表達等方法有助于鑒定hMSCs； 4．人胚胎MSCs在精原細胞培養(yǎng)條件下誘導培養(yǎng)，細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞突起變少變短，甚至看不到突起，胞體由長梭形變成圓形或橢圓形。免疫組織化學顯示此時的細胞膜和細胞質Oct-4、C-kit染色呈陽性，而CD44、CD105呈陰性