骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化成軟骨細(xì)胞過程中特殊microRNAs表達(dá)變化的研究.pdf

1、研究背景： 關(guān)節(jié)軟骨損傷退變是骨科臨床上尚未完全解決的難題，老年人以軟骨退變?yōu)橹?，年輕人則以運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷引起的軟骨損傷為首要原因，晚期發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，可引起疼痛和病殘，導(dǎo)致生活質(zhì)量降低、醫(yī)療費(fèi)用增加等問題。關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力十分有限，臨床上的自身修復(fù)多以纖維軟骨組織的形式來填補(bǔ)缺損，采用自體組織或同種異體組織如自體骨軟骨復(fù)合物、軟骨細(xì)胞、軟骨膜等修復(fù)軟骨缺損，對(duì)緩解疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能具有一定的

2、療效，但關(guān)節(jié)軟骨來源有限、供區(qū)周圍軟骨退變，修復(fù)區(qū)軟骨退變、免疫排斥反應(yīng)等，都可使臨床遠(yuǎn)期療效并不理想。組織工程軟骨為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)帶來了希望，成為關(guān)節(jié)外科的研究熱點(diǎn)，但軟骨損傷修復(fù)的機(jī)制仍不是很清楚，作為種子細(xì)胞的干細(xì)胞定向成軟骨細(xì)胞分化的效果與體內(nèi)正常的軟骨細(xì)胞仍然有一定差異，而干細(xì)胞的來源有很多，如骨髓、脂肪、血液等，其中以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived stem cells，BMSCs)最能模擬體內(nèi)

3、軟骨損傷自我修復(fù)的過程。現(xiàn)有很多促使干胞細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的方法，但仍需進(jìn)一步改善，因此一定程度上阻礙了組織工程軟骨的應(yīng)用，因此了解干細(xì)胞，尤其是BMSCs定向成軟骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)理則顯得尤為重要。 已有報(bào)道指出 microRNAs在胚胎軟骨發(fā)育過程中表達(dá)有時(shí)間特異性，其對(duì)干細(xì)胞的增殖、分化起著重要作用，有可能參與調(diào)控軟骨組織的發(fā)育、成熟及生物學(xué)特性的維持。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一類長(zhǎng)度約～22個(gè)核苷酸肽

4、的非編碼RNAs，在轉(zhuǎn)錄后染色體中發(fā)揮阻遏基因表達(dá)的功能[1，2]，主要是通過和靶mRNA序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶mRNAs的裂解或抑制它們有效翻譯。在生物機(jī)體發(fā)育的不同階段，miRNAs廣泛參與機(jī)體生理、病理過程[3]，例如胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。在不同的動(dòng)物中，約1～3％的基因?yàn)閙iRNAs[4]，約1/3的人類基因潛在的受miRNAs調(diào)控，且每個(gè)miRNA的平均靶基因大于200個(gè)[5]，英具有多基因調(diào)控的功能，在復(fù)雜的細(xì)

5、胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，尤其是功能蛋白表達(dá)的控制方面，因此特殊的miRNAs將可能是調(diào)控BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵因子。本課題在體外誘導(dǎo)BMSCs定向成軟骨細(xì)胞分化過程中檢測(cè)miRNAs(共10個(gè)：miR-140、miR-196b、miR—346、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表達(dá)情況，尋找差異性表達(dá)的miRNAs，試圖藉此誘導(dǎo)BMCS

6、s分化為軟骨細(xì)胞或改善其分化為軟骨細(xì)胞的能力和/或功能，同時(shí)尋找其相應(yīng)的靶基因，將可能對(duì)軟骨再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)生積極的科學(xué)意義。 目的： 1.研究胎兒和SD大鼠BMSCs體外定向成軟骨細(xì)胞分化過程中miRNAs的 變化。 2.預(yù)測(cè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNAs的靶基因。 3.綜述miRNAs在軟骨領(lǐng)域的研究進(jìn)展。 方法： 1.采用梯度密度離心法獲取胎兒和SD大鼠的BMSCs，體外擴(kuò)增培養(yǎng)，

7、并通過觀察形態(tài)學(xué)，描繪生長(zhǎng)曲線和計(jì)算倍增時(shí)間等方法了解其體外擴(kuò)增生長(zhǎng)的特性，及成軟骨誘導(dǎo)液對(duì)其生長(zhǎng)擴(kuò)增能力影響的研究。 2.運(yùn)用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液，分別在體外對(duì)BMSCs進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)，分別通過鈣結(jié)節(jié)染色和油紅O染色證實(shí)其具有體外多向分化的功能。 3.運(yùn)用細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)體系體外誘導(dǎo)BMSCs定向成軟骨細(xì)胞分化，分為2組：BMSCs細(xì)胞團(tuán)+完全培養(yǎng)液；BMSCs細(xì)胞團(tuán)+成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，培養(yǎng)3個(gè)

8、星期，分別在1w、2w、3w時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞團(tuán)塊，RNA標(biāo)本置于—80℃冰箱和組織學(xué)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋切片。采用Alcian blue和Safranin O組織學(xué)染色方法，及幾型膠原免疫組化染色方法，對(duì)誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行成軟骨鑒定。 4.收集所有誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞團(tuán)塊標(biāo)本，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT—PCR檢測(cè)BMSCs定向成軟骨細(xì)胞分化過程中10個(gè)感興趣miRNAs(miR-140、miR-196b、miR—3

9、46、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表達(dá)情況。 5.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得差異性表達(dá)的miRNAs，通過miRNAs數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因。 6.檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，綜述miRNAs在軟骨領(lǐng)域的研究進(jìn)展。 結(jié)果： 1.胎兒和SD大鼠的BMSCs體外擴(kuò)增良好，形態(tài)學(xué)穩(wěn)定，胎兒BMSCs倍增時(shí)間與SD大鼠BMSCs倍增時(shí)間相似

10、，細(xì)胞體積和核均較大，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液促進(jìn)BMSCs分化能力，減弱其增殖能力。 2.BMSCs在體外經(jīng)過3w成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，鈣結(jié)節(jié)染色呈陽性反應(yīng)；經(jīng)過3w成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)脂滴油紅染色呈陽性反應(yīng)；經(jīng)過體外細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)3w成軟骨細(xì)胞，組織學(xué)切片Alcian blue和Safranin O軟骨基質(zhì)染色成陽性反應(yīng)，證實(shí)獲取的BMSCs具有體外多向分化的功能。 3.BMSCs細(xì)胞團(tuán)分別經(jīng)完全培養(yǎng)液和成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液培養(yǎng)3w后，

11、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液組纓胞團(tuán)的Alcian blue和Safranin O染色呈陽性反應(yīng)，同時(shí)п型膠原免疫組化染色也呈陽性反應(yīng)，而完全培養(yǎng)液組細(xì)胞團(tuán)塊相應(yīng)的常規(guī)組織學(xué)染色和免疫組化染色呈陰性反應(yīng)。 4.miRNAs的實(shí)時(shí)定量RT—PCR檢測(cè)結(jié)果提示，與對(duì)照組比，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組的miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表達(dá)量增加有顯著差異性，miR-134在胎兒標(biāo)本中表達(dá)

12、增加，而在SD大鼠標(biāo)本中表達(dá)降低，顯示其表達(dá)的組織特異性，而miR—367和miR—34b在兩組的表達(dá)差異不明顯，miR—290在sD大鼠誘導(dǎo)的和沒有誘導(dǎo)的BMSCs中均不表達(dá)。 5.透過miRNAs數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因，hsa—miR-196b對(duì)應(yīng)同源盒蛋白(Homeobox protein Hox—B8)，hsa—miR—302a/b/367對(duì)應(yīng)酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine—protein kinase JAK1)，r

13、no—miR—346對(duì)應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子1(Nucleolar transcription factor1)，mmu—miR-140對(duì)應(yīng)聚合酶5(polymerase，epsilon)，mmu—miR-134對(duì)應(yīng)解聚素和金屬肽酶域33(a disintegrin and metallopeptidase domain33，ADMD33)，rno—miR—346對(duì)應(yīng)Col2A1，TGF—β1/3，IGF-1，mmu—miR—34b對(duì)應(yīng)ADAMT

14、S4/5，以上靶基因主要涉及軟骨發(fā)育、軟骨退變、細(xì)胞周期和炎癥信號(hào)通路等，需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和探索。 結(jié)論： 成功在體外培養(yǎng)胎兒和sD大鼠的BMSCs，且它們均具有多向分化的功能。BMSCs在體外定向成軟骨細(xì)胞分化過程中，miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表達(dá)量增加有顯著差異性，miR-134在胎兒標(biāo)本中表達(dá)增加，而在SD大鼠標(biāo)本中表達(dá)降低，顯示了其組織