胎盤羊膜和絨毛膜間充質干細胞生物學特性及羊膜間充質干細胞移植修復大鼠局灶性腦缺血的實驗研究.pdf

1、間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的干細胞，有著潛在的臨床應用價值。以往研究主要集中在人骨髓來源的間充質干細胞，但由于人骨髓來源的間充質干細胞的獲得需要通過骨髓穿刺，而且其數(shù)量隨年齡的增長而急劇下降，限制了人骨髓源間充質干細胞的應用。近年來有實驗表明，MSCs還可從臍血、胎盤、羊水、臍靜脈內皮下層、外周血及肌肉等組織中分離得到。其中，胎盤組織最受關注，它除了在胎兒發(fā)育、

2、營養(yǎng)支持和維持耐受中發(fā)揮重要作用外，含有豐富的成體干細胞，成為尋找人類成體干/祖細胞的新組織來源。胎盤來源MSCs的表型、分化潛能與骨髓MSCs相似，且胎盤作為孕婦分娩后的廢棄物，易于獲得且對其研究和應用無倫理道德的爭論，目前已成為間充質干細胞來源的新的研究熱點。
　　 胎盤羊膜中胚層(Amniotic Mesoderm)和絨毛膜中胚層（Chorionic Mesoderm）分別是體外分離獲得羊膜間充質干細胞(Amniotic

3、Mesenchymal stem cells，AMSCs)和絨毛膜間充質干細胞(Chorionic Mesenchymal stem cells，CMSCs)的組織來源，兩者均由胚胎發(fā)育過程中的胚外中胚層(Extroembryonic Mesoderm)發(fā)育而來，但是隨著胚外中胚層被分割并與不同的胚胎組織發(fā)生相互作用，分布于不同位置的胚外中胚層組織發(fā)生了不同的變化，這些變化是否會導致體外分離培養(yǎng)獲得的MSC具有不同的生物學特性，進一步深

4、入研究不同來源MSCs生物學特性，將為不同疾病模型的修復提供更有針對性的種子細胞。
　　 本研究旨在建立了有效的AMSCs和CMSCs體外擴增體系，比較兩群MSCs的生物學特性，并在此基礎上，將AMSCs通過立體定向技術注入大鼠局灶性腦缺血MCAO模型（大腦中動脈閉塞腦出血模型，middle cerebral artery occlusion model，MCAO模型）腦內，觀察植入細胞的存活、遷移、分化及大鼠神經(jīng)功能恢復，初步

5、探討AMSCs移植治療局灶性腦缺血的作用和可能機制。
　　 第一部分AMSCs和CMSCs組織分布及體外擴增體系的建立。
　　 目的:分析AMSCs、CMSCs在人胎盤組織中的分布特性、并建立相應的體外擴增體系。
　　 方法:取健康產(chǎn)婦正常剖宮產(chǎn)之足月胎兒的新鮮胎盤組織，鈍性分離羊膜層與絨毛膜層，采用不同方法對羊膜、絨毛膜組織進行消化及體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)AMSCs、CMSCs的細胞形態(tài);流式細胞儀分

6、別檢測其表面標志;采用多種誘導條件分別將兩群MSC細胞向脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞方向誘導，并用特異性染色法對誘導后細胞進行鑒定。比較多種因子不同濃度下對CMSCs體外擴增效果，選取75ng/mlFL進一步比較其對兩群MSC細胞的擴增效果，流式細胞儀檢測優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的兩群MSC的細胞表型;細胞計數(shù)分析FL對兩群MSCs的促增殖作用;RT-PCR分析兩群MSC中FL受體flt3基因表達;分別將FL作用下的兩群MSC細胞向脂肪細胞、軟

7、骨細胞及骨細胞方向誘導，RT-PCR分析脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞特異性基因在誘導后兩群MSC細胞中的表達情況。
　　 結果:(1)免疫熒光染色顯示:羊膜組織中CD90和CD166陽性細胞主要分布于羊膜上皮和羊膜間質中，而絨毛膜組織中CD90和CD166陽性細胞主要分布血管內皮下、血管附近間質內;免疫組織切片染色結果顯示:羊膜上皮、絨毛膜板間質內以及絨毛中軸血管周圍間質內可見CD105陽性染色的細胞;(2)倒置顯微鏡觀察AMSC

8、s、CMSCs均呈典型的成纖維細胞樣貼壁生長，流式細胞儀分析顯示，兩群MSC均高表達CD73、CD90和CD105，不表達CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(3)體外擴增培養(yǎng)的AMSCs、CMSCs成骨誘導后，細胞均由長梭形向立方形轉變，Von Kossa染色可見細胞呈集落生長并出現(xiàn)鈣結節(jié);成軟骨誘導2周后，AMSCs、CMSCs形態(tài)逐漸變得扁平，anti-collagen typeⅡ免疫組織化學染色可見陽性細胞表達Ⅱ型膠原;

9、成脂肪誘導2周，培養(yǎng)的兩群MSC細胞內均有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色陽性;(4)細胞計數(shù)結果表明，含F(xiàn)L的培養(yǎng)基能有效地促進兩群細胞的體外增殖，且FL對CMSCs的促增殖作用更強;(5)流式細胞儀分析顯示，含F(xiàn)L的培養(yǎng)基培養(yǎng)的兩群MSC仍高表達CD73、CD90、CD105，不表達CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(6) RT-PCR結果顯示，AMSCs、CMSCs均表達flt3的mRNA;添加FL培養(yǎng)的兩群MSCs向脂肪細胞

10、、軟骨細胞和骨細胞誘導后，表達PLIN（脂肪細胞）、ACAN（軟骨細胞）和RUNX2（骨細胞）特異性基因。
　　 結論:從人胎盤羊膜、絨毛膜組織經(jīng)過特定的分離消化后，能有效地獲得AMSCs和CMSCs兩群MSCs細胞，流式細胞術及誘導分化結果提示獲得的兩群MSCs均具有MSCs干細胞標志及誘導分化能力，可以成為體外優(yōu)化培養(yǎng)的種子細胞;FL具有較強的促AMSCs、CMSCs體外增殖作用而對CMSCs的促增殖作用更為明顯，同時其能保

11、持兩群MSCs的細胞形態(tài)、細胞表型及多向分化潛能，因此FL可以作為體外培養(yǎng)、擴增CMSCs的良好生長因子。
　　 第二部分AMSCs和CMSCs生物學特性的比較。
　　 目的:分析AMSCs、CMSCs的生物學特點，比較其向神經(jīng)細胞分化和成血管潛能的差異。
　　 方法:取培養(yǎng)2代以后的AMSCs、CMSCs細胞，采用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(1-Methyl-3-isobutylxanthine，IBMX)，對

12、兩群MSC細胞進行神經(jīng)細胞方向誘導，繼而采用PT-PCR方法對分化細胞誘導前及誘導后不同時間神經(jīng)特異性蛋白表達情況進行比較分析，免疫細胞化學方法對分化的細胞進行鑒定;取培養(yǎng)2代以后的AMSCs和CMSCs細胞，將血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導7天的兩群MSCs接種于Matrigel膠上，利用基質膠上毛細血管樣結構的形成實驗比較兩群誘導細胞的體外成血管能力。
　

13、　 結果:(1) RT-PCR結果顯示，誘導前AMSCs表達nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tujl)以及GFAP，而CMSCs僅有nestin的表達;誘導兩天后，AMSCs除了仍舊有nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tuj1)、GFAP的表達以外，還有NF表達，但CMSCs仍舊只有nestin的表達;誘導五天后，AMSCs對各蛋白表達情況與誘導兩天的結果相似，只是nestin的表達量

14、有所下降，而CMSCs中除nestin以外，還有NF和GFAP表達，以上結果均說明AMSCs較CMSCs具有更好的神經(jīng)生物學特性，更易于向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞分化;(2)基質膠上毛細血管樣結構的形成實驗顯示，兩群MSC細胞均能在基質膠上形成毛細血管樣結構，但AMSCs較CMSCs形成毛細血管樣結構慢;在毛細血管樣結構的數(shù)目上，兩種細胞間也有明顯的差異，CMSCs形成的毛細血管樣結構數(shù)明顯多于AMSCs。
　　 結論:在胎盤發(fā)育過

15、程中，由于兩群MSC細胞所接受的胚胎誘導不同，導致其表現(xiàn)出不完全相同的生物學特性，其中AMSCs表現(xiàn)出更強的神經(jīng)前體樣細胞的生物學特性而CMSCs具有較強的體外成血管能力。
　　 第三部分AMSCs移植對于局灶性腦缺血的修復作用及可能機制。
　　 目的:運用AMSCs移植治療局灶性腦缺血，觀察移植后實驗動物神經(jīng)功能的恢復情況，分析其可能的修復作用及相關機制。
　　 方法:采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，將腦缺

16、血大鼠隨機分為空白組和實驗組，分別將PBS、BrdU標記的AMSCs通過立體定向植入大鼠紋狀體內。分別于不同時間采用神經(jīng)損傷嚴重缺損評分(Neurological Severity Scores，NSS)，平衡木試驗(Beam Balance Test，BBT)，以及抬高身體搖擺試驗(Elevated BodySwing Test，EBST)對實驗動物的神經(jīng)功能進行評分，8周后處死大鼠取腦組織，行HE染色、BrdU免疫組化染色，觀察植入

17、AMSCs的存活、遷移情況。
　　 結果:應用線栓法短暫閉塞大鼠右側大腦中動脈后，大鼠出現(xiàn)左側肢體不同程度偏癱同時伴有右側Homer氏征。神經(jīng)功能行為學檢測顯示:AMSCs移植大鼠NSS、BBT、EBST在細胞移植后1、3、6、8周與PBS對照組比較有顯著好轉(P＜0.01)，8周后，AMSCs組可見較多BrdU表達陽性的細胞，細胞集中在移植位點及周圍區(qū)域，有向缺血灶遷移的趨勢，局部無膠質增生和淋巴細胞浸潤。
　　 結論

18、:AMSCs腦內移植能有效改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能癥狀，是治療局灶性腦缺血的一種可能措施。
　　 綜上所述，本課題建立了AMSCs和CMSCs有效的體外擴增體系，結合胚胎發(fā)育過程中，羊膜、絨毛膜各自的發(fā)育特點，比較兩群MSCs向神經(jīng)細胞分化及體外成血管的生物學特性的差異，并在此基礎上，通過體內動物實驗證實具有良好神經(jīng)生物學特性的AMSCs在大鼠局灶性腦缺血MCAO模型的修復中效果顯著，為進一步探討AMSCs移植治療局灶性腦